低浓度Aβ(1-42)单体/寡聚体及一氧化碳供体对SN56细胞存活率的影响

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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种神经退行性疾病,以认知功能障碍和记忆缺失为主要临床表现,成为目前危害老年人健康的重要疾病,且其发病率有逐年升高的趋势。1906年AD的典型临床表现和病理特征被Alois Alzheimer第一次系统清晰地描述,但到现在,人们对AD确切病因的认识仍不完全。AD以脑内β-淀粉样多肽(Beta-amyloid peptide, Aβ)在老年斑中的不规则自发组装、沉积和神经纤维缠结为主要特点。其中Aβ(1-42)是受损脑内老年斑的主要淀粉样成分,表明其在淀粉样神经退行性改变和相关的AD神经行为损害中的关键作用。容易引起AD发病的Aβ(1-42)的存在形式及浓度存在很多争议,也是近年来国内外研究的重点。内生性一氧化碳(Carbon monoxide, CO)是体内一种重要的化学递质,在某些细胞类型中可以起到抗细胞凋亡的作用,而它在神经细胞中的作用尚待明确。最近,转换型金属羰基复合物已被确认为一种潜在的一氧化碳释放分子(Carbon monoxide releasing molecules, CORMs),因为其拥有将CO传递到周围组织和器官,而易化CO药理作用的能力。它含有CO和一系列重金属,如钴、铁、镍、钌等。由这些金属释放的CO可以受到光激活、温度、PH值和周围环境的调节。三羰基三氯代钌二聚物(Tricarbonyldichlororuthenium (II) dimer),已经被证实为CORMs新家族中的一员,通常被称为——CORM-2。大量研究证实,它可以对某些细胞起到抗凋亡的作用,因此目前已经被当做一种有效的CO供体,广泛的应用于实验研究中。目的:1通过观察低浓度的Aβ(1-42)单体/寡聚体对SN56细胞存活率的影响,来了解SN56细胞对低浓度Aβ(1-42)的易感性。2通过观察Aβ(1-42)单体/寡聚体与不同浓度的CO供体——CORM-2共同作用下SN56的细胞存活率的变化,来了解CORM-2能否对胆碱能SN56细胞起到保护作用。方法:1细胞培养SN56细胞培养于37℃,95%空气,5%CO2环境中。以浓度为0.05%的EDTA-Ca2+胰蛋白酶消化传代。将传代后的细胞以相同浓度种植于96-孔细胞培养板中,待其充分增殖及贴壁后(3天左右),在1mM双丁酰环磷酰胺(cAMP)及1μM视磺酸(RA)环境中分化3天,得到分化的SN56细胞。2分组将细胞分为四组,分别为:对照组、Aβ(1-42)组、Aβ(1-42)+CORM-2 50μM组、Aβ(1-42)+CORM-2 100μM组。将96-孔板的前三列设为空白对照组,不加任何处理因素,其余每列按顺序分别加入Aβ(1-42) 10nM、Aβ(1-42) 100nM、Aβ(1-42) 1μM、Aβ(1-42) 10nM+CORM-2 50μM、Aβ(1-42) 100nM+CORM-2 50μM、Aβ(1-42) 1μM+CORM-2 50μM、Aβ(1-42) 10nM+CORM-2 100μM、Aβ(1-42) 100nM+ CORM-2 100μM、Aβ(1-42) 1μM+CORM-2 100μM。培养3天后对各组进行细胞存活率的测定。3 MTT法检测细胞存活率96-孔板每孔加MTT溶液11μl。然后在CO2温箱孵育3小时。每孔加入异丙醇和氯化氢的混合液111μl,反复抽吸混匀放置2-5min。以570nm波长测定各孔光吸收值,记录并标化成细胞死亡率。4统计方法实验结果用x±s表示,数据处理采用SPSS13.0统计软件,多个独立样本的比较进行Kruskal-Wallis检验,两相关样本比较进行Wilcoxon检验,P<0.05有统计学意义。结果:单纯Aβ(1-42)组细胞存活率分别为(79.73±0.94)%、(67.99±0.79)%、(60.42±0.62)%,随Aβ(1-42)浓度增加而下降。Aβ(1-42)与CORM-2 50μM共同作用后,细胞存活率为(75.15±0.096)%、(63.20±0.17)%、(55.33±0.19)%,分别比单纯Aβ(1-42)组存活率下降。Aβ(1-42)与CORM-2 100μM共同作用后细胞存活率分别为:(73.20±0.27)%、(64.34±0.11)%、(54.17±0.12)%,较单纯Aβ(1-42)组降低,但与Aβ(1-42)+CORM-2 50μM组比较,其降低细胞存活率的作用存在差异。结论:低浓度Aβ(1-42)单体/寡聚体可降低SN56细胞的存活率,并且浓度越高,效果越明显,表明其对SN56细胞的作用与浓度密切相关;不同浓度的CORM-2均可以使SN56细胞的存活率下降,并且作用强度存在差异。因此,可以认为一定浓度的CORM-2并没有对SN56细胞起到保护作用,而是加重了细胞的死亡,但CORM-2的作用强度与剂量的关系有待于进一步明确。
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