研究背景胶质瘤是非常常见的颅内肿瘤,占颅内恶性肿瘤的80%,根据临床病理标准,胶质瘤分为四个级别(I-IV)。高病理级别的胶质瘤增殖能力强,与患者不良预后相关。充分认识胶质瘤增殖的分子机制,对于实施新的治疗策略,以改善患者的预后非常重要。胶质瘤的增殖与某些功能性蛋白的表达相关,如:诱骗受体3(Dc R3),肿瘤坏死因子受体超家族成员的表达,和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)。已经有报道,胶质瘤所表达的功能性蛋白持续激活有丝分裂原激活的蛋白激酶/ERK激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)促进胶质瘤细胞的增殖和迁移。研究鉴定影响胶质瘤增殖的蛋白是非常有意义的,因为这些蛋白可以作为胶质瘤治疗的新靶点,提高治疗效果。脆性X综合症(FXS)是一种X染色体连锁的单基因病,主要发病原因是FMR1基因缺失或突变导致脆性X智力低下蛋白(FMRP)表达缺失。FMRP是RNA结合蛋白,在神经细胞突触联系中起关键的作用。突触在细胞与细胞间通讯连接中起关键的作用,随着时间的推移,突触可以对刺激的反应产生变化或耐受,这就是突触的可塑性,这种突触的特性对于人的记忆和学习是非常重要的。FMRP通过结合m RNA分子把这些m RNA分子从细胞核带到细胞的其它部位,在这些部位蛋白质被合成,FMRP可以调节蛋白的合成,而有些受FMRP调节的蛋白对于维持神经元的正常功能起重要作用。FMRP与m RNA相结合调节蛋白翻译和运输,而且有助于靶向的m RNA稳定。研究FMRP调控哪些m RNAs是非常重要的,人们用了多种方法研究FMRP所结合的m RNAs,在脑组织中有1000种以上的m RNAs与FMRP结合,在非神经元细胞中有6000种以上的m RNAs是FMRP的靶点。与FMRP结合的许多m RNAs所编码的蛋白与突触的活性、细胞粘附、细胞骨架结构重塑相关。FMRP的缺失导致所结合的m RNAs调节障碍,功能性蛋白表达失控,患者出现FXS的临床表现,表现为多种神经系统的症状,包括智力障碍、躁狂、强迫、焦虑和抑郁。有研究报道,在FXS患者中,FMRP表达缺失导致MEK/ERK/PI3K/m TOR/GSK-3β的信号受到抑制。近年研究FMRP在脑组织中的功能提示FMRP的表达与肿瘤相关。例如,FMRP在乳腺癌和肝癌中表达升高与肿瘤侵袭和转移相关。非常有趣的是,在患有FXS的患者中,颅内肿瘤进展的风险很小。有一个患有FXS的患儿同时患中脑不可手术的胶质母细胞瘤,在确诊后存活8年还没有神经系统症状。但FMRP在FXS中缺失与胶质瘤进展缓慢相关还未见报道。在本课题中,我们重点阐明FMRP与神经胶质瘤增殖的关系,阐明FMRP在神经胶质瘤中发挥作用的分子机制。材料与方法1、脑星形胶质细胞瘤组织标本我们回顾性分析了广州医科大学附属第二医院2004年1月到2014年10月的医学影像资料,收集被诊断为星形胶质瘤的组织标本。入组74例脑星形胶质瘤石蜡包埋的组织标本,在74例标本中,有42例是WHO病理分级2级,32例是WHO病理级别III级或IV级。WHO病理级别III级或IV级标本被界定为高级别胶质瘤,II级被界定为低级别胶质瘤。在胶质瘤石蜡标本中,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、KI67和FMRP的表达水平,由两位病理学家鉴定。24例脑星形胶质细胞瘤新鲜标本和6例脑外伤患者脑组织新鲜标本来自广医二院2013年3月到2014年3月手术患者。2、FMRP在不同病理级别胶质瘤中的表达差异及预后分析用western blot的方法检测不同病理级别星形胶质瘤组织和脑外伤患者的脑组织标本中FMRP的表达。通过H&E或免疫组化的方法检测不同病理级别胶质瘤组织中GFAP、Ki67、FMRP的表达。用Image-Pro Plus 6.0软件,分析FMRP的阳性染色,计算阳性染色的积分光密度。计算Ki67和FMRP阳性染色细胞的百分率。同时分析在星形胶质细胞瘤中FMRP的表达与Ki67间的关系。用Kaplan-Meier生存曲线分析星形胶质细胞瘤患者总生存期与FMRP或Ki67表达的关系。3、FMRP在两个星形胶质瘤细胞系中的表达及与胶质瘤细胞增殖的关系用western blot的方法检测胶质瘤细胞系U251/U87 BT325/SHG44细胞系中的表达。检测U251/U87 BT325/SHG44细胞增殖的比率。4、FMRP促进星形胶质瘤细胞增殖用脂质体包裹靶向FMR1基因的si RNA,转染星形胶质瘤细胞系U251、U87,以沉默细胞中FMRP的表达。用MTT和Ed U摄入实验检测U251和U87细胞增殖的情况,说明FMRP促进胶质瘤细胞增殖。5、FMRP在星形胶质瘤细胞中诱导MEK/ERK信号通路的激活在FMRP-si RNAs转染入U251或U87的条件下,用western blot的方法检测FMRP、PTEN、PDK1、AKT、m TOR、GSK-3β、MEK和ERK,用免疫荧光的方法检测FMRP和MEK,说明FMRP在星形胶质瘤细胞系中诱导MEK/ERK信号通路的激活。6、体内实验证明FMRP促进星形胶质细胞瘤增殖转染携带GFP-sh RNA或FMRP-sh RNA的慢病毒载体感染进入U251星形胶质瘤细胞后,用western blot方法检测FMRP的表达。将上述处理的U251细胞植入裸鼠的皮下,在不同时间点检测移植瘤的体积。对移植瘤的石蜡切片进行H&E和免疫组化染色,检测GFAP、Ki67或FMRP。7、统计分析所用统计分析用SPSS19.0完成。实验结果1、FMRP在星形胶质细胞瘤中的表达与肿瘤增殖相关,与患者的预后相关。用western blot的方法检测FMRP在24例新鲜胶质瘤标本中的表达,以6例外伤性脑组织为对照,结果表明,与对照组相比,在IV级星形胶质细胞瘤中FMRP的蛋白水平升高5.1倍,III级肿瘤升高3.2倍。74例胶质瘤患者组织标本免疫组化检测表明,随着病理级别的升高,GFAP的表达逐渐降低,FMRP和Ki67的表达逐渐升高,分析FMRP+细胞和Ki67+细胞的百分率表明,在病理III级和IV级病例中明显升高(P<0.05或P<0.01)。在Ki67+率≤5%时FMRP+细胞的百分率明显高于Ki67+细胞>5%时FMRP+细胞百分率为(P<0.01)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,Ki67+细胞比率低或FMRP+细胞的IOD值低的患者预后明显改善(P<0.001或P<0.01)。这些结果表明FMRP高表达与星形胶质细胞瘤增殖快相关,与患者的不良预后相关。2、FMRP通过MEK/ERK信号通路促进星形胶质瘤细胞增殖。在星形胶质瘤细胞系中探讨FMRP的表达与肿瘤增殖的关系,结果表明FMRP高表达的细胞系的增殖能力强(P<0.01)。用两个不同的FMRP-si RNAs分别转染胶质瘤细胞,用MTT检测胶质瘤细胞增殖,结果表明,FMRP的高表达与星形胶质瘤细胞的增殖相关,FMRP表达受到抑制后,与未转染组比,U251的增殖被抑制33.3%和43.0%,U87增殖被抑制37.1%和44.1%(P<0.05和P<0.01)。在Ed U摄入实验中也得到了相似的结果。这些结果说明FMRP在星形胶质细胞瘤增殖中起关键的作用。进一步研究FMRP表达下调的情况下,信号通路的激活状态。把两个FNRP-si RNAs分别转染入U251或U87细胞,不能改变PTEN/PDK1/AKT/GSK-3β/AKT3的磷酸化激活状态。但两条si RNAs均抑制MEK/ERK的磷酸化激活,对照组转染GFP-si RNA或单纯转染试剂组没有这样的作用。免疫荧光实验证明在UTR51/U87细胞中,FMRP-si RNAs降低MEK的表达。这些数据表明,FMRP通过MEK/ERK信号通路促进星形胶质瘤细胞的增殖。3、在内实验中证实FMRP促进星形胶质瘤增殖。把携带FMRP-sh RNA的慢病毒载体感染进入U251细胞,植入裸鼠皮下,感染lenti-FMRP-sh RNA的慢病毒载体降低移植瘤的体积,在第9天降低37.2%(P<0.05),第12天降低44.2%(P<0.05),第15天降低36.3%(P<0.01)。在第15天携带lenti-FMRP-sh RNA组移植瘤的重量降低61.5%(P<0.01)。对移植瘤进行免疫组化分析,结果表明,感染lenti-FMRP-sh RNA组FMRP和Ki67的表达降低,而提高了GFAP的表达。总的来说下调FMRP-sh RNA可以下调34.7%Ki67的表达(P<0.05),可以下调77.1%FMRP的表达(P<0.05)。所有这些数据说明FMRP在体内促进星形胶质瘤增殖。研究结论结论表明,FMRP通过MEK/ERK信号通路促进星形胶质细胞瘤增殖。1、FMRP和Ki67均随着病理级别的升高而升高,高病理级别的星形胶质细胞瘤FMRP的表达水平高,FMRP与星形胶质细胞瘤的增殖密切相关;2、FMRP的表达水平与星形胶质细胞瘤患者的预后密切相关,FMRP的表达水平越高,患者的预后越差。3、FMRP促进星形胶质瘤细胞增殖,FMRP的高表达上调MEK的表达,从而通过激活MEK/ERK信号通路促进星形胶质细胞瘤增殖;4、FMRP在裸鼠星形胶质细胞移植瘤中的表达与Ki67密切相关,FMRP促进裸鼠体内星形胶质细胞移植瘤的生长。