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目的:本实验拟利用足细胞培养技术从细胞水平研究IgA肾病、微小病变、膜性肾病患者的血清和尿液对小鼠足细胞Synaptopodin和Podocalyxin表达的影响,并进一步探索足细胞特异性分子与蛋白尿的关系,便于明确足细胞特异性分子与原发性肾小球疾病严重程度的相关关系,为原发性肾小球疾病的诊断和治疗开辟新的路径。研究背景:近年来研究发现,在膜性肾病、微小病变、IgA肾病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎、以及新月体肾炎的发病或进展中,足细胞损伤可能是致病关键,而关键之关键有可能是足细胞表面标志蛋白的表达异常。足细胞表面标志蛋白表达异常可以直接或间接影响足细胞正常结构发生变化,导致足细胞正常结构消失,功能异常,最终肾小球足细胞脱落,导致多种肾小球疾病的发生、发展。肾小球足细胞顾名思义即肾小球的一部分,是肾小球的脏层上皮细胞,是高度分化成熟的上皮细胞,功能复杂。由功能与结构各异的细胞体、主突、足突(FP)三部分构成。相邻的足突间有直径约为25nm的裂孔,厚度约为4-6nm,构成拉链状的裂隙膜(SD)覆盖在靠近肾小球基底膜外侧(GBM)上,是肾小球滤过屏障的最外层。当肾小球滤过屏障的通透性增加时就会有蛋白的漏出。肾小球足细胞足突可分为三个功能不同的膜性结构即顶膜区、裂孔隔膜区(SD)、基底膜区(与GBM相连)。足突内含像podocin、nephrin、actin等足细胞蛋白构成的肌动蛋白骨架。足细胞骨架蛋白已被证实的功能有:对肾小球血管袢固有空间结构的稳定;对足细胞动静态结构的维持;对肾小球内压力的抵抗;对血管内皮生长因子的分泌及合成;对肾小球内皮细胞功能完整性的维持;及血浆蛋白滤过的电荷、分子屏障的构成。另外还包含一些生物活性因子的衍生、细胞因子的变化、及内吞作用。近几十年发现的足细胞表达的特异分子蛋白按区域可分为:SD蛋白复合体(Nephrin及其同源物;Podocin;CD2相关蛋白;TRPC6;经典钙黏素(P-cadherin)、原钙黏素FAT;紧密连接蛋白ZO-1等)、基底膜区与GBM相连的蛋白(A3B1整合素;Dystroglycans)、顶膜区蛋白(Podocalyxin;肾小球上皮蛋白-1等)、肌动蛋白相关蛋白(Synaptopodin;A-actinin-4;Ezrin)、肿瘤相关蛋白(WT1)。足细胞表达的特异分子蛋白的表达情况直接或间接影响到肾脏疾病的发生、发展及预后。方法:本实验所需的原发性肾小球疾病病例数为30例(包括IgA肾病10例、微小病变10例、膜性肾病10例)血清和尿液的留取:选取2011年3月至2012年12月确诊为原发性膜性肾病的患者10例,在河北医科大学第二医院肾内科住院并行肾穿刺活检临床和病理证实,其中肝炎筛查阴性、自身抗体阴性、肿瘤标记物阴性,未服用激素及免疫抑制剂及肾脏保护药物包含ACEI或ARB。除外高血压、糖尿病、遗传性肾炎。其中10例患者在临床上表现为24h尿蛋白定量均>3.5g,血肌酐正常,eGFR>90ml/min。原发性IgA肾病患者血清和尿液:取2011年3月至2012年12月10例患者于河北医科大学第二医院肾内科住院并行肾穿刺活检临床和病理确诊为原发性lgA肾病,除外过敏性紫癜、系统性红斑狼疮、银屑病、肝硬化等,未用过激素及免疫抑制剂及肾脏保护药物包含ACEI或ARB,除外高血压、糖尿病、遗传性肾炎。临床上24h尿蛋白定量>1.0g但是<2.0g,血肌酐均正常,且eGFR>90ml/min。原发性肾小球微小病变:取2011年3月至2012年12月确诊为肾小球微小病变在河北医科大学第二医院肾内科行肾穿刺活检临床和病理证实的患者10例,除外重金属中毒等引起,未用过激素及免疫抑制剂及肾脏保护药物包括ACEI或ARB或他汀类降脂药,除外高血压、糖尿病、遗传性肾炎。临床上10例患者24h尿蛋白定量均>3.5g,血肌酐正常且eGFR>90ml/min。不同浓度的血清和尿液分别于12、24、48h刺激体外培养的小鼠足细胞行免疫细胞化学染色。通过病理图像分析仪检测Podocalyxin和Synaptopodin指标的表达强度。结果:免疫细胞化学染色结果显示,在IgA组、微小病变组浓度为5%的血清和10%尿液对Synaptopodin的表达影响是48小时内表达强度随时间的延长而有所增加,对照组无明显变化;而IgA组、微小病变组浓度为5%血清和10%尿液对Podocalyxin的表达影响则是在48小时内随时间的延长而有所下降,对照组无明显变化;在膜性肾病组浓度为5%血清和10%尿液对Synaptopodin的表达影响是在48小时内于24小时时有短暂升高之后下降,对照组无明显变化;而在膜性肾病组浓度为5%血清和10%尿液对Podocalyxin的影响依旧是在48小时内随时间的延长表达逐渐下降,对照组无明显变化(P<0.05)。三种不同病理类型患者血清和尿液刺激的小鼠足细胞检测Podocalyxin组细胞形态变瘦,细胞数目变少;而检测Synaptopodin组细胞数目与形态变化均不大。在不同类型肾脏疾病间相比较Synaptopodin或Podocalyxin的表达无统计学意义(P>0.05)。结论:通过刺激过后肾小球足细胞表面标志蛋白Podocalyxin和Synaptopodin表达发生的改变,表明特异分子表达的异常对不同类型原发性肾小球疾病发生发展产生的影响差异性不具有统计学意义,在单一类型疾病中表达趋势影响明显且具有统计学意义。在不同类型肾脏疾病中对蛋白尿多少的影响本实验未能检测出,需要进一步研究。