肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率男性多于女性,根据最新统计,在全世界发展中国家的男性中,肝癌是癌症死亡的第二大原因,在发达国家的男性中,排名癌症死亡的第六位。据统计,在2012年期间全世界大约有78.25万新增肝癌病例,因肝癌死亡的人数大约74.55万例,而我国就占了新增病例及死亡病例总数的50%。肝细胞癌是肝癌的主要类型,占肝癌的70-90%。然而肝细胞癌形成和发展的具体机制仍不清楚,缺乏有效治疗方法。目前手术切除仍是治疗肝细胞癌的首选方法,然而根治性切除后患者的5年复发率高、转移率高,这成为肝细胞癌临床治疗的难题。因此,从分子水平研究肝细胞癌的发生机制,并针对此寻找有效的治疗措施成为当今肝细胞癌研究中的重点和难点。REC8是构成染色体结构维持蛋白复合体黏着素中的一员。黏着素在细胞有丝分裂及减数分裂中发挥调整染色体分离和同源重组的作用,参与DNA损伤修复,在真核细胞增殖过程中起着至关重要的作用。染色体的正确分离对于细胞的增殖非常重要,染色体的分离异常与多种疾病相关,尤其在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。同时黏着素在转录过程中可以与DNA结合调控增强子与启动子的相互作用。能够参与多种基因的表达调控,如原癌基因、癌基因的表达调控,同时与CCCTC-结合因子(CCCTCbinding factor,CTCF)共定位于染色体,通过CTCF的作用调控转录,因此黏着素在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。REC8是黏着素家族中新近发现的一员,它属于黏着素减数分裂特异亚基,进入减数分裂Ⅰ期,RAD21被减数分裂特异的黏着素亚基REC8取代。同时REC8是肿瘤/睾丸(Cancer/Testis,CT)基因的一员,这类基因生理状态下在生殖细胞系高表达,在癌症中被异常激活,它们在癌症细胞生理学的作用仍有待阐明。近期研究发现在胃肠间质瘤中出现REC8的异常甲基化,在多倍体肿瘤细胞中表达异常,在胃癌、甲状腺癌中表现出抑癌作用。目前,国内外尚未见到有关REC8在肝细胞癌中的表达及其作用机制的研究报道。本研究观察REC8在人类肝细胞癌组织及肝癌细胞系的表达,研究其对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管形成等生物学行为的影响,并探讨它在肝癌细胞中的作用机制,为肝细胞癌提供新的治疗靶点。第一部分:REC8在肝细胞癌组织及肝癌细胞中的表达目的:观察REC8在肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达情况,以及REC8在肝癌细胞系和肝细胞系的表达情况。方法:收集河北医科大学第二医院肝胆外科2015年1月-2016年12月行手术切除并经术后病理证实为肝细胞癌患者40例。实验标本共80例,包括新鲜肝细胞癌组织标本40例及相应癌旁组织40例。应用免疫组织化学染色法、Real-time PCR、蛋白质免疫印迹法检测REC8在肝细胞癌组织及相应癌旁组织的表达水平及特点,应用细胞免疫荧光染色分析、蛋白免疫印迹法检测肝癌细胞以及肝细胞中的REC8的表达水平及特点。结果:1 REC8在肝癌组织中主要定位于细胞核,在癌旁组织中主要定位于细胞浆,在肝癌组织细胞核中表达较癌旁组织增高免疫组织化学染色结果REC8在肝细胞癌组织及癌旁组织中均有表达,但在肝细胞癌组织中REC8主要定位于细胞核,在癌旁组织中REC8主要定位于细胞浆,REC8在细胞核的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)。Real-time PCR结果显示在肝癌组织中REC8 m RNA的表达与癌旁组织没有显著差别(P>0.05)。蛋白免疫印迹法结果显示在肝癌组织中REC8在细胞核的表达水平高于癌旁组织(P<0.01),提示REC8可能在肝细胞癌的发生发展中发挥作用。2 REC8在肝癌细胞中主要表达于细胞核,在肝细胞中主要表达于细胞浆,在肝癌细胞系细胞核中表达较肝细胞增高细胞免疫荧光染色分析的结果表明在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中REC8主要表达于细胞核,而在QSG-7701肝细胞中REC8在细胞核、细胞浆均有表达,主要表达于细胞浆。蛋白免疫印迹法实验检测肝癌细胞、肝细胞细胞核内的REC8表达,当上样蛋白总量为150μg时结果显示三种肝癌细胞系中细胞核内REC8的表达高于肝细胞(P<0.05),提示REC8可能在肝细胞癌的发生发展中发挥作用。第二部分:REC8对肝癌细胞生物学行为的影响目的:应用pcDNA3.1-Flag-REC8质粒转染肝癌细胞建立REC8过表达肝癌细胞模型,观察REC8对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移侵袭、血管生成能力等生物学行为的影响。方法:应用pcDNA3.1-Flag-REC8质粒分别转染Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞(REC8组),以空载体(Control组)作为对照组,之后再利用蛋白免疫印迹检测PCNA蛋白表达、细胞克隆形成实验、CCK-8实验观察肝癌细胞增殖能力的变化;使用蛋白免疫印迹法检测Cleaved-Caspase3蛋白表达、流式细胞仪Annexin V/PI双染细胞凋亡观察肝癌细胞凋亡的变化;应用蛋白免疫印迹法检测MMP-9、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验观察肝癌细胞迁移、侵袭能力的改变;应用蛋白免疫印迹法检测VEGF-C、小管形成实验观察肝癌细胞对血管形成能力的改变。结果:1 pcDNA3.1-Flag-REC8质粒过表达REC8的效果鉴定应用pcDNA3.1-Flag-REC8质粒分别转染Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞,以空载体作为对照组,转染pcDNA3.1-Flag-REC8质粒后REC8的m RNA水平和蛋白水平均明显上调(P<0.01),证实pcDNA3.1-Flag-REC8质粒在三种肝癌细胞中均可成功过表达REC8。2过表达REC8抑制肝癌细胞的增殖蛋白免疫印迹法分析结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中PCNA表达均下降(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,过表达REC8后,抑制肝癌细胞的增殖能力。细胞克隆形成实验结果表明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中细胞克隆形成数量减少(P<0.01),表明过表达REC8后,肝癌细胞克隆形成受到抑制。CCK-8实验结果表明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒24h、48h、72h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞增殖能力均下降(P<0.05)。3过表达REC8促进肝癌细胞的凋亡蛋白免疫印迹法分析结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中Cleaved-Caspase3表达均上升(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,过表达REC8促进肝癌细胞的凋亡。流式细胞仪Annexin V/PI双染细胞凋亡检测实验证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中细胞早期凋亡率升高(P<0.01),表明过表达REC8促进肝癌细胞的凋亡。4过表达REC8促进肝癌细胞的迁移、侵袭蛋白免疫印迹法分析结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中MMP-9表达均上调(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,过表达REC8增加肝癌细胞的迁移、侵袭能力。Transwell侵袭实验结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞的侵袭能力增加,穿到Transwell小室下层的细胞数增加(P<0.01),表明过表达REC8增加肝癌细胞的侵袭能力。细胞划痕实验侵袭实验结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞的划痕愈合能力增加(P<0.01),表明过表达REC8增加肝癌细胞的迁移能力。5过表达REC8促进肝癌细胞的血管形成蛋白免疫印迹法分析结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,在Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞中VEGF-C表达均上调(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,过表达REC8增加肝癌细胞的血管生成能力。小管形成实验结果证明,与Control组比较,转染REC8过表达质粒48h后,Hep G2、Hu H-7、BEL-7402三种肝癌细胞对血管形成能力增加(P<0.01),过表达REC8增加肝癌细胞的血管生成能力。第三部分:REC8通过PKA通路促进肝癌细胞的迁移侵袭及血管生成目的:通过免疫共沉淀联合质谱分析筛选与REC8相互作用的靶蛋白,探讨REC8促进肝癌细胞迁移侵袭及血管生成的作用机制。方法:通过免疫共沉淀以及细胞免疫荧光染色的方法验证REC8与靶蛋白的相互作用。在过表达REC8后应用靶蛋白抑制剂干预肝癌细胞系并应用蛋白免疫印迹法检测MMP-9、VEGF-C的表达、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验、小管形成实验验证其功能。结果:1在肝癌细胞中REC8与PKA RII-α存在相互作用通过免疫共沉淀联合质谱分析后筛选与REC8相互作用的靶蛋白58个,其中PKA RII-α与细胞的迁移侵袭、血管形成关系密切。我们应用免疫共沉淀进行验证,沉淀产物以PKA RII-α抗体进行蛋白免疫印迹法检测时出现阳性结果,提示PKA RII-α与REC8可能存在相互作用。应用PKA RII-α抗体进行沉淀,沉淀产物以REC8抗体进行蛋白免疫印迹检测出现阳性结果。我们进一步应用细胞免疫荧光染色检测REC8与PKA RII-α是否存在相互作用,发现REC8染色定位于细胞核,PKA RII-α染色同时定位于细胞核,两者间存在共定位,提示REC8与PKA RII-α存在相互作用。2在肝癌细胞中REC8通过与PKA RII-α作用使PKA活性升高蛋白免疫印迹法结果证明,过表达REC8后对PKA RII-α表达无明显影响(P>0.05)。PKA活性测定结果显示,过表达REC8后PKA活性升高(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,REC8促进PKA活性上升。以上两个结果提示REC8通过与PKA RII-α作用使PKA活性上升但不影响其表达。3 REC8通过PKA通路促进肝癌细胞的迁移侵袭蛋白免疫印迹法分析结果证明,过表达REC8后应用PKA抑制剂H89,肝癌细胞Hu H-7中MMP-9表达下降(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,REC8通过PKA通路上调MMP-9的表达,从而促进肝癌细胞的迁移侵袭。PKA抑制剂H89可抑制REC8过表达诱导的迁移、侵袭(P<0.01)。Transwell侵袭实验显示REC8通过PKA通路影响肝癌细胞的侵袭能力。细胞划痕实验显示REC8通过PKA通路影响肝癌细胞的迁移能力(P<0.01)。4 REC8通过PKA通路促进肝癌细胞的血管生成蛋白免疫印迹法分析结果证明,过表达REC8后应用PKA抑制剂H89,肝癌细胞Hu H-7中VEGF-C表达下降(P<0.01),表明在肝癌细胞系中,REC8通过PKA通路上调VEGF-C的表达,从而促进肝癌细胞的血管生成能力。小管形成实验结果证明,过表达REC8后应用PKA抑制剂H89,肝癌细胞Hu H-7对血管形成能力减低,表明在肝癌细胞系中,REC8通过PKA通路促进肝癌细胞的血管生成。结论:1 REC8在肝细胞癌组织及肝癌细胞中主要表达于细胞核,在癌旁组织及肝细胞主要表达于细胞浆,提示REC8可能在肝细胞癌的发生发展中发挥作用。2 REC8抑制肝癌细胞的增殖,促进其凋亡、迁移、侵袭和血管生成。3 REC8通过PKA通路促进肝癌细胞的迁移侵袭和血管生成。