论文部分内容阅读
本论文分为两大部分：第一部分：探索ITSN1-S在胶质瘤细胞迁移和侵袭中的功能及相关分子机制；第二部分：研究ITSN1-S在胶质瘤细胞凋亡中的作用及相关分子机制。ITSN1(intersectin-1)是一种在进化上保守的衔接蛋白,有研究表明其参与介导了细胞的胞吞胞吐以及细胞内信号转导等一系列生理过程。ITSN1具有S和L(短链和长链)两个亚型。我们的前期研究工作表明,在中枢神经系统中长链亚型仅在神经元中表达,短链亚型主要在胶质细胞中表达,提示两个亚型可能具有与其独特的分布特征相对应的功能特点。本研究旨在初步探索短链亚型在胶质瘤细胞侵袭和凋亡中的功能以及可能的分子机制。第一部分摘要[目的]探讨降低ITSN1-S的表达对胶质瘤细胞运动和侵袭能力的影响并阐明其相关的分子机制。[方法]应用小RNA干扰质粒和瞬时转染的方法转染胶质瘤细胞株LN-229和U87,采用Western blotting技术检测这两种细胞中ITSN1-S蛋白的表达。划痕实验、趋化运动实验检测胶质瘤细胞的运动能力；体外侵袭实验检测胶质瘤细胞的侵袭能力；细胞粘附实验检测胶质瘤细胞的粘附能力；F-actin聚合实验检测细胞骨架的聚合能力；应用Western blotting技术检测ITSN1-S降表达后PAK/LIMK/cofilin的磷酸化,验证ITSN1-S参与胶质瘤细胞肌动蛋白聚合的分子机制；采用Western blotting技术检测ITSN1-S降表达后N-cadherin、β-catenin的表达水平以及FAK.Integrinβ1的磷酸化水平对胶质瘤细胞粘附能力的影响；Western blotting技术检测MMP-2和MMP-9的表达,验证ITSN1-S的降表达是否影响胶质瘤细胞基质金属蛋白酶的表达；Western blotting技术检测Akt的磷酸化验证影响胶质瘤细胞迁移及侵袭的分子机制；通过裸鼠皮下成瘤在体实验验证ITSN1-S的降表达对胶质瘤细胞体内侵袭能力的影响。[结果]胶质瘤细胞株LN-229和U87经转染以后,ITSN1-S蛋白表达量明显下降；ITSN1-S降表达的胶质瘤细胞的趋化运动能力和迁移能力较对照组细胞显著下降(P<0.05)；细胞F-actin聚合能力较对照细胞下降；胶质瘤细胞的粘附能力在5min、15min时比对照组显著降低(P<0.05)；体外胶质瘤细胞侵袭实验结果显示,ITSN1-S降表达后细胞的侵袭能力较对照组细胞显著减弱(P<0.05)；体内侵袭实验进一步证实,在成瘤以后,实验组裸鼠发生组织侵润的数量较对照组显著减少(P<0.05)。[结论]ITSN1-S在胶质瘤细胞迁移和侵袭过程中发挥重要作用。ITSN1-S能够通过磷酸化PAK/LIMK/cofilin调节胶质瘤细胞肌动蛋白聚合反应；ITSN1-S通过磷酸化FAK/integrinβ1以及调节N-cadherin/β-catenin的表达从而影响胶质瘤细胞的粘附能力；ITSN1-S通过上调MMP-9的表达增强胶质瘤细胞向细胞外基质侵袭的能力,ITSN1-S能够活化Akt参与调节胶质瘤细胞的迁移和侵袭；。第二部分摘要[目的]本研究旨在探索ITSN1-S亚型在调节胶质瘤细胞凋亡中的功能以及可能的分子机制。[方法]本研究利用小RNA干扰技术降低ITSN1-S在胶质瘤细胞LN-229中的表达；利用生长曲线检测胶质瘤细胞的生长情况；流式细胞术、MTT以及TUNEL染色的实验方法测定胶质瘤细胞的凋亡,Western blotting技术检测凋亡相关蛋白分子细胞色素C(cytochrome C, Cyt-c)、Bcl-2和Bad的表达情况,并进一步通过裸鼠皮下成瘤的方法观察肿瘤在体生长情况。[结果]转染后的LN-229细胞ITSN1-S的蛋白表量达明显降低；ITSN1-S表达降低后细胞生长速度明显减慢(P<0.05),细胞凋亡显著增加(P<0.05),Cyt-c从线粒体的释放增加,体内移植瘤生长受到显著抑制(P<0.05),凋亡相关蛋白分子Bcl-2的表达降低,Bad表达升高,胞浆中细胞色素C表达增加。[结论]降低ITSN1-S的表达能够抑制胶质瘤细胞的生长,促进细胞凋亡；这些作用可能是ITSN1-S通过介导线粒体凋亡途径实现的。