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细胞凋亡是一种高度有序的程序性死亡的方式,它主要通过两条途径来启动:死亡受体途径和线粒体介导的途径。因此,激活细胞凋亡途径成为抗癌药物研究的新热点,目前已成为抑制恶性肿瘤增殖的一种治疗手段。双氢青蒿素(DHA),是我国学者首次从菊科植物黄花蒿(Artemisia annua)中提取的新型的一线抗疟疾药,近年来的越来越多的研究证明,其还具有抗肿瘤的作用。虽然前人付出了很多努力研究双氢青蒿素的抗肿瘤机制,但是双氢青蒿素对人肺腺癌细胞的作用机制仍然不清楚。
本文第一章绪论部分总结了凋亡信号转导通路的研究现状,概述了双氢青蒿素目前的国内外研究现状,荧光能量共振转移(FRET)等荧光技术的基本原理及其应用,同时说明了本课题研究的目的和意义。
本文的实验工作主要分为三个部分:
在第一部分的实验工作中,首次采用激光扫描共焦显微成像、FRET受体漂白技术和荧光光谱检测技术在人肺腺癌细胞(ASTC-a-1)中检测了DHA诱导细胞凋亡中caspase-3的活化。我们的实验结果表明:(1)DHA以剂量与浓度依赖性的方式诱导细胞凋亡;(2)在单个细胞水平监测到了DHA诱导的caspase-3的活化,在蛋白水平了进一步确证了DHA诱导的caspase-3的活化;(3)线粒体途径可能参与了DHA诱导的细胞凋亡(包括线粒体肿胀与膜电位的下降)。本章在对DHA诱导的人肺腺癌ASTC-a-1细胞凋亡的机制研究中取得初步的进展,对DHA诱导ASTC-a-1细胞凋亡的后续研究奠定了良好的基础。
在第二部分的实验工作中,我们首先通过CCK-8和流式细胞仪的实验检测由DHA诱导了ROS依赖性的细胞凋亡。基于此,我们第一次在活细胞中运用共聚焦荧光成像,FRET和荧光漂白恢复技术(FRAP)技术来检测DHA诱导ROS依赖性的Bax的转位,线粒体功能的紊乱,cytochrome c从线粒体中释放,以及caspase-8,caspase-9和caspase-3的活化。有一点必须要指出的是过表达Bcl-xL显著的抑制了DHA诱导的Bax的转位,并且DHA诱导产生的ROS是DHA下调Bcl-xL的表达的主要原因,因此,在本文中我们推测ROS可能是通过下调Bcl-xL来调控DHA诱导的Bax转位。另外,我们还发现Bim,另一个Bcl-2家族中重要的促凋亡因子,在DHA的刺激下,发生了向内质网而不是向线粒体的转位并且DHA的刺激能明显上调BimL与BimS这两种蛋白亚型的表达。这些结果都为DHA成为可能的抗癌药物治疗肺腺癌提供初步的理论依据。
在第三部分的实验工作中,我们证明SP600125,JNK的抑制剂,通过加速Bax的转位和随后的线粒体膜去极化,cytochrome c的释放,caspase-9和caspase-3的活化的内源性凋亡途径,协同促进双氢青蒿素诱导的人类肺腺癌细胞凋亡。FRAP方法动态分析单个活细胞内GFP-Bax的移动性得到的结果表明SP600125加速双氢青蒿素诱导的Bax的移动性的下降和Bax的转位。这些结果首次证明了SP600125在双氢青蒿素诱导的凋亡过程中的新的促凋亡作用。