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目的犬博卡病毒MVC(Minute Virus of canine)是细小病毒家族博卡病毒亚家族的成员之一。而VP2作为MVC病毒的结构蛋白,不仅是构成衣壳蛋白的主要成分,更是细小病毒的主要免疫原性抗原,其具有凝血活性的物质,是作为决定宿主范围以及宿主与病毒之间相互作用的关键影响因素。因此,本文通过构建MVC的VP2结构蛋白的原核表达载体,通过诱导表达、纯化目的蛋白,免疫兔子、制备针对VP2的多克隆抗体,为进一步研究VP2在MVC病毒致病及感染中的作用,深入揭示MVC病毒致病及感染的分子机制奠定研究基础。方法(1)以本实验室保存的博卡病毒MVC的感染性克隆载体p IMVC为模板PCR扩增VP2基因,并将其产物纯化。将纯化产物与表达载体p ET32a(+)经EcorⅠ、XhoⅠ同时双酶切,经T4连接酶连接,转化到克隆菌株Ecoli.DH5α以及表达菌株Ecoli.BL21,通过双酶切鉴定正确后,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测和鉴定目的蛋白的表达。目标蛋白经大量表达后,回收细菌超声裂解并Ni柱纯化,以纯化产物作为完全抗原免疫新西兰大白兔。(2)ELISA检测抗体效价。(3)以MVC感染WRD(Walter Reed Dog)嗜性细胞,然后运用Western blot和免疫荧光技术鉴定抗体特异性。结果(1)DNA序列测定及双酶切鉴定结果均显示MVC-VP2基因成功构建至原核表达载体p ET32a(+)上,原核表达产物经SDS-PAGE鉴定后证实成功表达一相对分子量(Mr)约为39kd的目的蛋白条带,VP2目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。(2)以纯化得到的MVC-VP2重组蛋白免疫制备得到兔血清,ELISA方法测得其效价为1:200 000。(3)Western blot、免疫荧光方法证实VP2多抗血清能够成功检测MVC感染的WRD细胞,并且具有特性。结论成功构建了MVC结构蛋白基因VP2的原核表达载体p ET32a(+)-VP2,并表达了相应的可溶性蛋白。制备了高效价博卡病毒MVC的VP2多克隆抗体,具有很好的特异性。