农杆菌介导慈竹4CL基因遗传转化梁山慈竹的研究

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木质素是一类酚类次生代谢产物,在植物体内行使重要的生理功能,但它却是形成造纸污染的主要来源。由于竹子难以开花,不适于应用传统方法进行遗传改良。因此,利用基因工程手段,在分子水平调节木质素的生物合成,以培育适合造纸的新竹种,具有较大的应用价值和环保效益。已有大量的研究表明,抑制植物内源4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)的基因表达可有效降低木质素含量,因此,4CL是改良造纸用材较为理想的目标基因。本研究室构建了慈竹PBI121-4CL-RNAi表达载体,但缺少竹子遗传转化体系。目前,竹分子生物学和遗传转化体系的研究十分落后,还没有建立适合遗传转化的技术体系,尤其是工业用大型丛生竹的研究。因此,开展梁山慈竹遗传转化体系研究和梁山慈竹转4CL基因植株的获得十分重要。   本研究以梁山慈竹两种不同类型的愈伤组织和无菌苗嫩茎为材料,采用农杆菌遗传介导的方法,将已构建好的具有降低木质素含量的PBI121-4CL-RNAi表达载体导入受体材料,探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度、AS(乙酰丁香酮)等因素对遗传转化的影响。本研究获得的主要结果如下:   初步建立了梁山慈竹遗传转化体系,以预培养8天的第一种类型(淡黄色、颗粒状、疏松易碎)的胚性愈伤组织为转化受体,在菌液浓度为OD600=0.05的EHA105中,28℃、110 rpm条件下,侵染20 min,然后在25℃、黑暗条件下共培养2天(共培养基表面加一层无菌滤纸),在含有卡那霉素为55 mg·L-1的抗性筛选培养基上筛选30天,获得的抗性愈伤组织,其在芽诱导培养基上培养30天,可获得丛生芽,待丛生芽长至3~5 cm后,在生根培养基上经过20~30天的诱导,可产生1~8条根,获得转基因植株。   对抗性愈伤组织和抗性植株经PCR检测表明,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹愈伤组织和再生植株中,并获得了转基因植株,转化效率为9%。RT-PCR检测结果表明,转4CL基因的梁山慈竹愈伤组织和植株的内源4CL基因的表达受到抑制,且表达量比对照明显降低。为最终培育出低木质素含量、更适于造纸的优质竹种奠定了基础。
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