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目的:观察香烟抽提物对气道上皮细胞黏蛋白(Mucin)5AC表达的影响及其信号转导机制。方法:(1)体外培养人气道上皮细胞系A549细胞,予以不同浓度的香烟抽提物(CSE)刺激24 h,观察刺激前后细胞的生长和增殖情况,并分别采用ELISA技术及PCR检测各组细胞中MUC5AC蛋白含量及转录水平的变化情况,测定活性氧成分的含量。(2)以未予任何处理的细胞为空白对照,分别设立CSE单纯刺激组;肿瘤坏死因子转换酶抑制剂-1(TAPI-1)预处理组;活性氧清除剂DMTU预处理组。各孵育24 h后,采用RT-PCR检测处理前后细胞中MUC5AC mRNA含量;ELISA检测培养上清中MUC5AC、可溶性转化生长因子(TGF)-α蛋白含量;Western印迹分析磷酸化表皮生长因子(p-EGFR)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)蛋白水平。(3)分别以JNK特异性抑制剂SP600125、Src激酶的特异性抑制剂PP2、活性氧清除剂DMTU为干预条件。采用RT-PCR技术检测干预前后细胞中黏蛋白MUC5AC转录水平的改变、ELISA测定培养上清液中MUC5AC蛋白水平,Western印迹分析细胞EGFR、JNK、c-Src的磷酸化蛋白水平。(4)设立TNF-α刺激组; CSE刺激组;CSE+TNF-α刺激组;空白对照组,24 h后分别测定各组培养上清中MUC5AC蛋白含量及细胞中MUC5AC mRNA水平;Western印迹分析p-EGFR蛋白含量;免疫细胞化学染色观察TNF-α作用3 h、24 h后MUC5AC、NF-κB在细胞中的表达及部位。结果:(1)低浓度的CSE作用24 h后,细胞生长并未受到抑制,一定程度上促进了其增殖;当浓度达40%后,细胞凋亡增加,出现较多死细胞,存活不能超过24 h。细胞中MUC5AC的蛋白含量及转录水平均呈浓度依赖性增高,ROS含量亦随之增加。(2)20%CSE刺激后引起MUC5AC基因转录和蛋白表达水平明显高于未给予CSE刺激的对照组(P<0.01),同时伴随可溶性TGF-α及p-EGFR、p-ERK、p-JNK蛋白水平的增高,与正常对照组相比,差异有统计学意义(p<0.01);加入浓度为20μmol/L的肿瘤坏死因子转换酶抑制剂TAPI-1后可显著下调MUC5AC的表达和TGF-α及p-EGFR、p-ERK蛋白含量,但对JNK的磷酸化无明显抑制作用(p>0.05);DMTU也同样降低了MUC5AC的基因转录、蛋白产物水平以及可溶性TGF-α蛋白、p-EGFR、p-ERK、p-JNK相对含量,与单纯CSE刺激组比较差异均有统计学意义(p<0.05),但对单纯外源性TGF-α刺激组引起的MUC5AC基因转录和蛋白合成增加无明显下调作用(p>0.05)。(3)JNK抑制剂SP600125显著下调香烟所致MUC5AC表达水平和分泌量的升高水平,而未对激活态EGFR水平的上升产生明显影响,Src的特异性抑制剂亦能通过减少JNK的磷酸化产生与SP600125相似的作用;DMTU能降低细胞中c-Src的磷酸化蛋白含量。(4)前炎性介质TNF-α能不同程度地引起MUC5AC基因转录增强及蛋白合成增加,p-EGFR蛋白含量增加;与CSE共孵育后上述水平增加更明显,差别具有统计学意义(p<0.05);同时作用也强于单纯CSE刺激组。TNF-α作用细胞3 h左右后,免疫细胞化学染色观察到NF-κBp65在核内表达增强,而作用24 h后,NF-κBp65阳性染色仍较多地位于胞浆,MUC5AC蛋白也在3 h后即开始表达增加,24 h后更明显,主要位于胞浆。结论:(1)CSE能刺激气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC基因转录及蛋白合成分泌增加,且伴有活性氧(ROS)含量的显著增高。(2)CSE能通过ROS/肿瘤坏死因子转换酶(TACE)途径并活化EGFR信号通路引起MUC5AC表达增强。(3)除依赖EGFR受体酪氨酸酶磷酸化引起MUC5AC转录生成增加外,ROS/Src/JNK非受体酪氨酸激酶信号途径也参与MUC5AC基因转录及蛋白合成,而并不依赖于EGFR的自身磷酸化。(4)前炎性因子TNF-α可协同并增强CSE所致的MUC5AC合成及黏液高分泌,伴有转录因子NF-κBp65的核转位;吸烟是细菌感染的易患因素,香烟刺激与感染及其产生的一系列后续效应是加重并恶化气道慢性炎性疾病的重要原因。