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虹鳟是典型的冷水性鱼类,对较高水温的耐受能力差,随着全球气候变暖,夏季高温对虹鳟养殖的威胁越来越严重,鉴定虹鳟应答高温刺激的相关基因,在基因表达的不同层次上理解热应激的响应策略和调控机理,可以为虹鳟耐高温遗传选育和改良、发掘虹鳟抗高温的各种措施提供理论基础。microRNA(miRNA)是一类对基因进行转录后调控的单链小分子RNA。目前,热应激下虹鳟miRNA的研究还未见文献报道,因此,本研究选取全同胞家系的虹鳟作为试验材料,取对照组(18℃)和热处理组(24℃)各3尾雌鱼的肝脏和头肾,用llumina HiSeq 2500测序平台和生物信息学方法,对虹鳟肝脏和头肾组织miRNAs进行系统性分析,鉴定热应激下差异表达的miRNAs,并揭示新的虹鳟特异miRNAs;接着分别从肝脏和头肾RNA-seq和small RNA-seq结果中筛选出稳定表达的mRNAs(肝脏5个,头肾5个)和miRNAs(肝脏4个,头肾5个),通过geNorm,NormFinder,BestKeeper和ComparativeΔCt四种方法同时评估这些基因和四个常用参考基因和一个小的非编码RNA(U6)的表达稳定性,筛选出热应激下虹鳟肝脏和头肾的内参mRNA和内参miRNA,随后用筛选出的内参miRNA对small RNA-seq结果进行RT-qPCR验证;同时,为了研究miRNA在热应激过程中对虹鳟的调控作用,本研究从small RNA-seq结果中筛选出差异表达的两个miRMAs(ssa-miR-301a-3p和ssa-miR-7132b-5p),预测其靶基因,并采用双荧光素酶报告基因检测系统对其靶向关系进行验证。主要结果如下:1.通过small RNA-seq,肝脏6个small RNA文库获得了88,452,735条原始数据(raw reads),去除低质量reads,5′接头及3′接头后,获得84,894,376条纯净序列(clean reads),用于后续分析。肝脏small RNA序列长度主要分布在21~23 nt范围内,其中22 nt序列分布的最多。共检测到363个已知miRNAs和638个新miRNAs;筛选出39个差异表达的miRNAs,其中20个表达水平上调,19个表达水平下调;共鉴定出65对miRNA-target gene负相关作用位点,包括18对miRNA上调-target gene下调和47对miRNA下调-target gene上调。GO和KEGG分析表明,潜在靶基因主要参与了DNA复制和蛋白质折叠等过程,主要富集在内质网蛋白质加工,NOD受体信号通路等通路上。2.通过small RNA-seq,头肾6个small RNA文库获得了85,873,242条原始数据(raw reads)。去除低质量reads,5′接头及3′接头后,获得82,295,067条纯净序列(clean reads),用于后续分析。头肾small RNA序列长度主要分布在21~23 nt范围内,其中21 nt序列分布的最多。共检测到392个已知miRNAs和989个新miRNAs;热应激前后筛选出78个差异表达的miRNAs,其中41个表达水平上调,37个表达水平下调;共形成393对miRNA-target gene负相关作用位点,包括217对miRNA上调-target gene下调和176对miRNA下调-target gene上调。GO和KEGG分析表明,潜在靶基因主要参与了蛋白质折叠等蛋白加工和代谢等过程,主要富集在内质网蛋白加工、NOD样受体信号通路和吞噬体等通路上。3.通过geNorm、NormFinder、BestKeeper和ComparativeΔCt四种方法筛选虹鳟肝脏和头肾热应激下的内参mRNA和内参miRNA,结果显示,β-actin和EF1-α分别是肝脏和头肾中表达最稳定的内参mRNA,ssa-miR-26a-5p和ssa-miR-462b-5p分别是肝脏和头肾中表达最稳定的内参miRNA。随后通过筛选出的内参miRNA对small RNA-seq中差异表达的miRNAs(肝脏8个,头肾8个)进行RT-qPCR验证,结果发现RT-qPCR的检测结果和small RNA-seq结果一致,证实了small RNA-seq结果的可靠性。4.运用生物信息学软件预测ssa-miR-301a-3p和ssa-miR-7132b-5p的靶基因(hsp90b2和HERC4)。成功克隆了hsp90b2 3′-UTR和HERC4 3′-UTR,构建了用于miRNA靶标检测的野生型(hsp90b2 WT和HERC4 WT)和突变型(hsp90b2 MUT和HERC4 MUT)重组载体。双荧光素酶报告基因检测系统发现,转染HEK 293T细胞48 h后,共转染野生型重组载体hsp90b2 WT时,与mimics NC组比较,ssa-miR-301a-3p mimics组的荧光活性显著下调(P<0.05);共转染突变型重组载体hsp90b2 MUT时,mimics NC组与ssa-miR-301a-3p mimics组的荧光素酶活性差异不显著(P>0.05),说明ssa-miR-301a-3p可以与hsp90b2基因的3′-UTR位点互补,两者之间存在靶向调控关系;转染HEK 293T细胞48 h后,共转染野生型重组载体HERC4 WT组或突变型重组载体HERC4 MUT时,与mimics NC组比较,ssa-miR-7132b-5p mimics组的荧光素酶活性均差异不显著(P>0.05),说明ssa-miR-7132b-5p不能与预测的靶基因HERC4互补结合,两者之间没有直接的靶向关系。