目的1.制备“五白散”祛斑凝胶贴膏并进行其质量标准、临床前药效学研究,为后续研究奠定基础。2.评价“五白散”传统散剂穴位贴敷疗法治疗黄褐斑的临床疗效,为黄褐斑的临床治疗提供一种切实可行的治疗方式;优化穴位贴敷疗法治疗黄褐斑的方案,评价“五白散”祛斑凝胶贴膏穴位贴敷疗法治疗黄褐斑的临床疗效,为穴位贴敷疗法治疗黄褐斑的临床推广应用提供一个新选择。3.基于网络药理学预测“五白散”祛斑凝胶贴膏治疗黄褐斑的作用机制并进行相关分子生物学实验验证,为“五白散”祛斑凝胶贴膏穴位贴敷疗法治疗黄褐斑提供科学依据。方法1.通过高效液相色谱法（HPLC）进行有效成分含量测定,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除实验、酪氨酸酶抑制实验,优化“五白散”中药复方提取工艺;通过体外透皮实验考察“五白散”祛斑凝胶贴膏的最佳氮酮含量,制备得到“五白散”祛斑凝胶贴膏。通过性状考察、薄层鉴别、赋形性、含膏量、黏性测定、含量测定等评价方法对“五白散”祛斑凝胶贴膏进行质量标准的评价;并进行皮肤刺激性实验、皮肤敏感性实验,完成“五白散”祛斑凝胶贴膏的安全性评价。将清洁级三色豚鼠随机分为正常组、模型组、“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组、“五白散”传统散剂贴敷组、空白凝胶基质贴敷组、阳性药物对照组,正常组不做处理,其余各组均给予黄体酮全身攻击+紫外线照射法制备豚鼠黄褐斑模型,造模成功后,正常组与模型组仅用空白敷贴进行贴敷处理,其余各组用相对应的贴片/药物进行贴敷/涂抹干预,每日贴敷治疗8h,连续贴敷30天。治疗结束后免疫组化染色观察各组豚鼠的黑素情况,采用羟胺法测定豚鼠皮肤组织匀浆的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、硫代巴比妥酸法测定豚鼠皮肤组织匀浆的丙二醛（MDA）含量。2.将符合纳入条件的90例黄褐斑患者随机分为“五白散”传统散剂贴敷组、“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组和阳性药物对照组,对3组患者进行相应的贴敷/涂抹干预,隔天1次,1个月为1个疗程,共治疗3个疗程。分别于各个疗程治疗前后进行皮损面积和皮损颜色评分,以及治疗前、第3疗程治疗后检测患者血清T-SOD活力、MDA含量。后于治疗结束1个月后进行随访,再次对患者进行皮损面积和皮损颜色评分,综合评价穴位贴敷疗法治疗黄褐斑的临床疗效。3.网络药理学研究:利用BATMAN数据库筛选“五白散”复方活性成分和潜在靶点,联合Drugbank、OMIM、Dis Ge NET、CTD、Gene Cards数据库获取黄褐斑相关靶点,利用Cytoscape 3.7.2软件中的插件Biso Genet将“五白散”复方和黄褐斑的潜在靶点分别扩充后取交集得到核心靶点,进而将核心靶点导入DAVID数据库对其进行KEGG通路的富集分析。动物实验验证研究:分别采用蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量PCR技术,检测正常组、模型组、“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组豚鼠皮肤的黑素生成以及EGFR/PI3K/AKT/GSK3β信号通路相关指标。结果1.制备、质量标准及临床前药效学研究各指标综合加权赋分后结果显示“五白散”中药复方最佳提取溶剂为先醇提后水提;正交试验结果显示“五白散”中药复方的提取工艺为A2B3C1,即先加8倍量的70%乙醇提取1次,倒出提取液后再加入10倍量的纯水进行提取,提取时间每次均为1h。透皮实验各指标综合加权实验结果显示1%氮酮含量的“五白散”祛斑凝胶贴膏渗透作用最好。完成了“五白散”祛斑凝胶贴膏的相关制剂检查;建立了欧前胡素、1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（MLTR）2个成分的薄层色谱鉴别方法,同时建立了两个成分的HPLC测定方法,暂定“五白散”祛斑凝胶贴膏的含膏量不低于15.8168g/100cm2。安全性评价的皮肤刺激性、皮肤过敏性实验结果显示72h内实验部位均未出现任何的红斑、水肿及其他异常现象。免疫组化结果显示:在阳性细胞比率、阳性细胞密度、平均光密度值、H-Score上“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组分别与模型组、空白凝胶基质贴敷组、“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组相比,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组上述4个指标的数值均低于其它组,差异有显著统计学意义（P＜0.01）;T-SOD活力测定结果显示:“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组分别与模型组、空白凝胶基质贴敷组、“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组相比,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组可显著提高T-SOD活力,差异有显著统计学意义（P＜0.01）;MDA含量测定结果显示:“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组分别与模型组、空白凝胶基质贴敷组、“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组相比,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组可显著降低MDA含量,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。2.临床研究临床皮损总评分结果显示:三组在第3疗程结束后分别与本组治疗前、第1疗程、第2疗程相比,皮损总积分均降低,差异有显著统计学意义（P＜0.01）;三组在第3疗程结束后组间比较,“五白散”传统散剂贴敷组与阳性药物对照组皮损总积分组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组与“五白散”传统散剂贴敷组皮损总积分组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组与阳性药物对照组比较,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组的皮损总积分低于阳性药物对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。三组在随访期分别与本组第3疗程结束后相比“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组皮损总积分降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,“五白散”传统散剂贴敷组皮损总积分差异无统计学意义（P＞0.05）,阳性药物对照组皮损总积分升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。T-SOD活力测定结果显示:三组在第3疗程结束后分别与健康对照组相比,T-SOD活力均低于健康对照组,差异均有显著性统计学意义（P＜0.01）;“五白散”传统散剂贴敷组与阳性药物对照组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组与“五白散”传统散剂贴敷组相比,T-SOD活力上升,差异有显著性统计学意义（P＜0.01）,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组与阳性药物对照组相比,T-SOD活力上升,差异有统计学意义（P＜0.05）;经秩和检验三组分别与本组治疗前相比,T-SOD活力上升,差异均有显著性统计学意义（P＜0.01）。MDA含量测定结果显示:三组在第3疗程结束后分别与健康对照组相比,MDA含量均高于健康对照组,差异均有显著性统计学意义（P＜0.01）;“五白散”传统散剂贴敷组与阳性药物对照组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）,“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组分别与“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组相比,MDA含量下降,差异有显著性统计学意义（P＜0.01）;经秩和检验三组分别与本组治疗前相比,MDA含量下降,差异均有显著性统计学意义（P＜0.01）。临床疗效方面:“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组总有效率93.3%,“五白散”传统散剂贴敷组总有效率83.3%,阳性药物对照组总有效率80.0%。在临床疗效方面“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组优于“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组相比疗效相当,差异无统计学意义（P＞0.05）。3.机制研究网络药理学研究方面:通过检索BATMAN数据库,删除重复值后,收集到“五白散”复方共113种成分,248个靶点。经过Drugbank、OMIM、Dis Ge NET、CTD、Gene Cards数据预测到治疗黄褐斑的156个潜在靶点。将“五白散”复方和黄褐斑的潜在靶点利用Cytoscape 3.7.2软件中的插件Biso Genet分别扩充后取交集,结合文献选取Degree值大于等于210的靶点,其中SOD1、TYR与黑色素生成密切相关,因此也予以保留。经DAVID数据库KEGG通路富集分析结果显示,潜在靶点总计参与20条信号通路（P＜0.05）,包括甲状腺激素信号通路、PI3K-AKT信号通路、Hippo信号通等。动物实验验证研究方面:Western blot结果显示:“五白散”祛斑凝胶贴膏可以显著降低黄褐斑模型豚鼠皮肤组织MITF、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白相对表达量（P＜0.01）,明显提高黄褐斑模型豚鼠皮肤组织EGFR、Pi3k、p-Pi3k、AKT1、p-AKT1、p-AKT1/AKT1蛋白相对表达量（P＜0.01）,升高黄褐斑模型豚鼠皮肤组织p-Pi3k/Pi3k蛋白相对表达量（P＜0.05）。q PCR结果显示:“五白散”祛斑凝胶贴膏可以显著降低黄褐斑模型豚鼠皮肤组织MITF、TYR、TRP-1、TRP-2m RNA相对表达量（P＜0.01）,明显提高黄褐斑模型豚鼠皮肤组织EGFR、Pi3k、AKT1m RNA相对表达量（P＜0.01）。结论1.“五白散”中药复方的最佳提取工艺为先加8倍量的70%乙醇提取1次,再加10倍量的水提取1次,每次1h。“五白散”祛斑凝胶贴膏的最佳氮酮含量为1%。本研究所制备的“五白散”祛斑凝胶贴膏均达到《中国药典》2020版所要求的质量标准,质量可靠,且72h内无任何刺激性及致敏性,可用于后续相关试验。“五白散”祛斑凝胶贴膏可降低黄褐斑豚鼠模型的黑素情况,提高豚鼠皮肤组织的T-SOD活力,降低豚鼠皮肤组织的MDA含量,通过抑制黑素生成及抗氧化达到治疗目的且疗效优于“五白散”传统散剂、阳性药物。2.“五白散”传统散剂穴位贴敷疗法与阳性药物对比,在有效改善黄褐斑患者的皮损情况以及抗氧化方面均与阳性药物作用相当,但是其在治疗黄褐斑时具有疗效持久稳定的特点。“五白散”祛斑凝胶贴膏贴敷组可有效改善黄褐斑患者的皮损情况,升高黄褐斑患者血清T-SOD活力,降低MDA含量,治疗期疗效以及远期疗效均优于“五白散”传统散剂贴敷组、阳性药物对照组,且临床使用更为规范、便捷。3.网络药理学研究显示“五白散”中药复方治疗黄褐斑具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点,经KEGG通路富集分析发现,EGFR/PI3K/AKT/GSK3β信号通路作用最为突出,基于此开展进一步的动物实验验证说明了“五白散”祛斑凝胶贴膏可能是通过调节EGFR/PI3K/AKT/GSK3β的信号转导,抑制黑素生成并抗氧化达到治疗黄褐斑的作用。