猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis,S S）是重要的人畜共患病原,可引起人和猪的脑膜炎,败血病和心内膜炎等,严重威胁养殖业和公共卫生安全。在所有血清型中,猪链球菌2型（SS2）分布最广,致病性最强,对人的威胁最大。在中国,1998年和2005年先后在江苏海安和四川资阳爆发了严重的人感染猪链球菌2型疫情。尽管目前已经发现许多毒力相关因子在SS2感染过程中发挥重要作用,但远不能彻底阐明其致病机制。新毒力相关因子寻找及已发现毒力相关因子的功能研究对于探明猪链球菌2型致病机制仍至关重要。近年研究发现,细菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶（Eukaryotic-like Ser/Thr protein kinase,eSTK）和磷酸酶（Eukaryotic-like Ser/Thrprotein phosphatase,eSTP）与致病性密切相关,底物谱广泛。有研究表明,猪链球菌2型eSTK（Stk）和eSTP（Stp1）在致病过程中发挥重要作用,但仍缺乏二者底物谱的详细报道。有报道发现猪链球菌折叠酶（Foldase,PrsA）可能是Stk的潜在底物,但尚未验证。研究表明致病性革兰氏阳性菌的PrsA可调控毒力相关蛋白分泌,参与致病过程。本实验室前期研究也发现,猪链球菌2型PrsA具有促炎效应和细胞毒性,但PrsA在猪链球菌致病中的作用及其是否调控猪链球菌毒力相关蛋白的分泌尚无报道。本研究的目的:（1）探明stk和stp1基因缺失对猪链球菌2型强毒株致病性的影响;（2）利用基因缺失株结合磷蛋白组学方法,解析Stk磷酸化和Stp1去磷酸化的底物及其生物学功能类型,并验证Stk和Stp1可能的共同作用底物;（3）探明PrsA是否能被Stk磷酸化,及是否对猪链球菌2型致病性和毒力相关因子分泌具有调节作用。1.stk和stp1缺失降低猪链球菌2型致病性我们分别构建了 SS2强毒株05ZYH33的stk和stp1无痕缺失菌株,Δstk和Δstp1。stk和stp1缺失株的链显著变长。stk缺失对细菌的生长无显著影响,而Δstp1与亲本株相比生长特性差异显著。Δstk和Δstp1对上皮细胞黏附能力均显著高于亲本株,而细胞侵袭能力、抗小鼠巨噬细胞吞噬以及在猪全血中的存活力均显著降低;Δstk的溶血能力显著高于亲本株,而Δstp1株变化不显著;两缺失株的生物被膜形成能力均显著增强;二者对小鼠的致病力显著低于亲本株。免疫印迹分析发现,SS2重要黏附因子GAPDH在Δstk和Δstp1株分泌蛋白和表面蛋白中的丰度均显著上升,可能是缺失株细胞黏附和生物被膜形成能力增强的重要原因;而猪链球菌溶血素（suilysin,SLY）在Δstk分泌蛋白中显著增多,是造成其溶血能力增强的原因。透射电镜观察发现,Δstk荚膜变薄,而Δstp1荚膜增厚,这可能是分别引起Δstk在吞噬细胞中的存活能力减弱而Δstp1在吞噬细胞中存活能力增强的主要原因。本研究首次发现Stk和Stp1参与调节猪链球菌2型的胞外蛋白分泌和荚膜形成。2.Δstk或Δstp1与其亲本株的磷蛋白组比较分析将stk和stp1缺失株及亲本株的菌体蛋白进行酶解消化、TiO2磷酸化肽段富集和LC-MS/MS质谱分析。总共鉴定到315个磷酸化肽段,属于206个磷酸化蛋白,包含453个磷酸化位点,主要以丝氨酸苏氨酸磷酸化为主,酪氨酸磷酸化最少:比例为 Phos-Thr=48.3%,Phos-Ser=47%,Phos-Tyr=4.64%。Δstk 与亲本株相比,有47个显著性差异修饰位点,其中1个显著上调,46个显著下调,另外有68个位点仅在亲本株中发生修饰。Δstp1与亲本株相比,有34个显著性差异修饰位点,其中16个显著上调,18个显著下调。生物信息学分析结果表明,Stk和Stp1修饰调控对SS2多种生物进程均有影响,如调节生物被膜形成、胞外蛋白分泌和细菌的分裂过程等。我们筛选到8个可能被Stk和Stp1共同修饰调控的蛋白。其中两个蛋白——细菌分裂相关蛋白（cell division protein）DivIVA的199位苏氨酸和RNA结合蛋白（RNA-binding protein）Jag的116位苏氨酸均在Δstk中的磷酸化水平显著下调,而在Δstp1中磷酸化水平显著上调。分别对Stk蛋白的N端激酶区、Stp1、DivIVA和Jag进行了原核表达,同时将Jag的116苏氨酸突变为不可被磷酸化修饰的丙氨酸（命名为Jag-116A）。体外磷酸化试验表明,DivIVA和Jag均可被Stk磷酸化并且被Stp1去磷酸化,证明二者是Stk和Stp1的共同底物;而Jag的1 16位苏氨酸突变为丙氨酸后,则不能被Stk磷酸化,证明116位苏氨酸是Stk对Jag的磷酸化修饰位点。3.PrsA通过调节毒力因子的分泌参与猪链球菌的致病过程已有报道发现PrsA可能是Stk的潜在磷酸化修饰底物。本研究中发现PrsA不能被Stk磷酸化。为探明PrsA在SS2致病过程中的作用,我们构建了 PrsA的无痕缺失株ΔprsA和互补株CΔprsA。prsA缺失后菌株链变长,生长变慢;ΔprsA对上皮细胞的黏附能力增强,但细胞侵袭能力、在巨噬细胞和猪全血中的存活能力均显著降低,且ΔprsA对BALB/c小鼠致死率显著低于亲本株。这些表型变化在基因回补后都基本恢复至亲本株水平。免疫印迹检测发现,SS2重要毒力因子溶血素SLY在ΔprsA表面蛋白和分泌蛋白中极显著减少,溶血活性分析也发现ΔprsA溶血活性显著降低。SS2两个重要黏附素（甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]和烯醇酶[enolase]）在ΔprsA菌体表面蛋白和分泌蛋白中均显著增加。GAPDH和enolase的多克隆抗体处理ΔprsA则可以显著抑制其对上皮细胞的黏附。以上结果表明,PrsA可以调控SS2毒力因子分泌和转位,影响SS2与宿主的互作,从而参与SS2致病过程。综上所述:（1）Stk和Stp1参与猪链球菌细胞黏附、侵袭和抗吞噬杀伤过程,是猪链球菌2型的毒力相关因子。首次发现Stk和Stp1可以通过调控毒力因子分泌和荚膜形成参与猪链球菌致病过程。（2）应用比较磷蛋白组学方法得到了 Stk和Stp1的修饰底物谱。其中DivIVA和Jag蛋白被验证为Stk和Stp1的共同底物。（3）猪链球菌2型可通过PrsA蛋白来调控毒力因子的转位,影响与宿主细胞的相互作用,增强SS2致病性。