随着人类生活方式的改变，工业化、城市化的发展以及农业生产大量使用化肥，大量的营养物质注入水体，湖泊富营养化日益严重。蓝藻是目前已知产生毒素最多、对人类健康造成的危害最大的藻类。有害藻类水华的频繁发生已成为国内外普遍关注的环境问题。水华藻类及其毒素已被列入微生物和有机污染物的检测项目。目前，世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛的增长趋势，发生的地点遍布全球各地。其中微囊藻是淡水水体中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的产毒蓝藻。国外学者先后报道了多起因微囊藻毒素污染导致人群、家畜、鱼类患病甚至死亡的事件。 微囊藻毒素是具生物活性的单环七肽。微囊藻毒素毒性是其能抑制导致蛋白磷酸化的丝氨酸／苏氨酸磷酸酶1和2A(PP1，2A)。微囊藻毒素经口，经腹腔注射，均可引起肝脏病变，引起细胞骨架损伤，肝坏死和肝内出血。也有报道称微囊藻毒素可引起肾毒性，引起肾小球内红细胞的减少，而周围红细胞增多，管径增大。更重要的是微囊藻毒素强促肿瘤物质。流行病学的研究表明在中国某些地区饮用沟渠中被蓝藻污染的水源的人群中，微囊藻毒素是原发性肝癌高发生的危险因素之一。微囊藻毒素还具有基因毒性，Repavich等报道在体外实验中微囊藻毒素导致人类的淋巴细胞染色体异常。最近又有报道微囊藻毒素能引起小鼠肝脏(活体)、体外培养的大鼠肝细胞、幼鼠肾细胞和小鼠的胚胎原纤维原细胞中的DNA的损伤。而且，发现微囊藻毒素LR 浙江大学博士学位论文可引起人类Rsa细胞K一ras第12密码子的碱基置换突变。目前对微囊藻毒素作用机制的进一步研究主要集中在肝脏受体、毒素的转运原理、毒素作用的分子机理，尤其是在促肿瘤的分子机制等方面。 虽然人们知道微囊藻毒素对生物体有毒性，但迄今为止其在分子水平上的致毒机理仍然不很清楚，并给其在环境中的安全性评价造成困难。因此本课题拟通过研究离体情况下微囊藻毒素致毒对细胞增殖、细胞周期、细胞通讯、DNA损伤和细胞凋亡的影响，以及活体情况下微囊藻毒素致毒对抗氧化系统酶、DNA损伤和细胞凋亡的影响，来探讨微囊藻毒素致毒机理。 按照实验设计，大鼠正常细胞BRL一3A在培养体系中加入不同浓度的微囊藻毒素LR进行染毒后进行不同的实验。用MTT法测定细胞增殖;用流式细胞术进行细胞周期测定;用激光扫描共聚焦显微镜对染毒细胞进行FRAP分析，测定GJIC功能;用DEvD一FMK抑制法测定。 aspase一3活性;收集细胞提取蛋白后用蛋白印迹法进行p53、Bcl一2和Bax蛋白表达测定。 25只雄性SD大鼠随机分为5组，微囊藻毒素LR按O、0.1、1、10和100林眺g体重对雄性SD大鼠经连续7d染毒，染毒方式为灌胃，每天一次。最后一次灌胃1h后，从股动脉采集血液放入事先加入肝素的试管中，立即进行彗星试验。取大鼠肝用液氮速冻后用蛋白印迹法进行p53、Bcl一2和Bax蛋白表达测定，并进行肝soD、cAT和GR的活性测定。 实验结果如下: 1.微囊藻毒素LR可以引起肝细胞BRL一3A的增殖，除1000Iu’n。比外，呈剂量一效应关系。利福平可以降低微囊藻毒素LR诱导的BRL一3A细胞增殖;微囊藻毒素LR和利福平两者间有显著的交互作用。 2.微囊藻毒素LR对BRL一3A细胞周期的影响主要体现在S期细胞的增加，表明微囊藻毒素LR染毒使得细胞变得活跃，细胞增殖加快。 浙江大学博士学位论文 3.微囊藻毒素LR可以显著地下调BRL一3A细胞GJIC功能，并呈剂量效应关系。利福平对微囊藻毒素LR诱导的BRL一3A细胞GJIC功能下调有明显的抑制作用。同样，在GJIC变化中微囊藻毒素一LR和利福平两者间有显著的交互作用。 4.BRL一3A暴露于微囊藻毒素LR后，不同浓度微囊藻毒素LR都可以引起BRL一3A细胞p53和Bax蛋白表达升高。除了1 onmol/L微囊藻毒素LR作用1h没有显著改变外，各浓度组在不同时间暴露后都可以引起BRL一3A细胞Bcl一2蛋白表达降低。而NRK暴露于不同浓度微囊藻毒素LR后Bax表达情况和BRL一3A是一致的。 5.微囊藻毒素LR在短时间、低浓度即可诱导caspase一3活性升高。随着微囊藻毒素LR浓度的增大，酶活性随之升高，当微囊藻毒素LR的浓度为500nmol/L时酶活性达到了最高峰，并且在浓度低于500lunol几时呈现剂量反应关系，当微囊藻毒素LR的浓度为I000moUL时，酶活性较500nmof/L浓度组有所降低，但差异不具有显著性。 6.大鼠染毒后淋巴细胞彗星试验结果表明，与对照组相比，各实验组尾长都显著增加，并且随着微囊藻毒素LR暴露浓度的升高，尾长也逐渐升高。结果表明微囊藻毒素LR的暴露对大鼠肝脏DNA造成了损伤。 7.不同浓度微囊藻毒素LR暴露后，除最低浓度组外，其它浓度组大鼠肝脏p53和Bax的表达显著升高。可以看出，随着微囊藻毒素LR暴露浓度的升高，p53和Bax的表达呈升高趋势。大鼠肝脏Bcl一2蛋白表达未见明显改变。 8.不同浓度微囊藻毒素LR暴露后的影响，与对照组相比，除1卜叭g外，其余浓度均导致大鼠肝的