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原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一。随着影像学技术的进步和三维适形放疗技术的发展,中晚期肝癌的放射治疗日益引起人们的关注。放疗效率的高低与肿瘤细胞的辐射敏感性密切相关,而敏感性在很大程度上受到p53基因的调控。肝癌细胞的p53状态存在多种形式,包括野生型p53(wtp53)、突变型p53(mtp53)和缺失型,具有不同状态p53的肝癌细胞应具有不同的辐射效应。近年来,人们发现了辐射旁效应这一新的现象,由于该效应的存在,受辐射的肝癌组织对周围未受辐射的肝癌组织或正常肝组织可能存在一定的影响,不同辐射敏感性的肝癌细胞所诱导的旁效应也可能存在差异,以上因素都可造成对肝癌放疗有效控制的难度有所增加。因此,深入研究不同p53状态肝癌细胞的辐射敏感性及其所诱导的旁效应,以及p53在受辐射肝癌细胞所诱导旁效应中的作用,有利于增加对不同类型肝癌放疗疗效的评估,并为如何更好的利用旁效应现象,提高放疗效率,降低放疗副作用提供理论依据。目的1.肝癌细胞的辐射敏感性与p53的关系以不同p53状态的三株肝癌细胞为研究对象,研究辐射对细胞增殖及对细胞微核发生率的影响,探讨不同p53状态肝癌细胞的辐射敏感性,为进一步研究受辐射肝癌细胞所诱导旁效应提供实验基础。2.p53在受辐射肝癌细胞所诱导旁效应中的作用通过检测γ射线照射不同状态p53的肝癌细胞所诱导的旁效应,以及P53在靶细胞与旁细胞中表达情况,研究p53与受辐射肝癌细胞所诱导旁效应的关系。方法1.肝细胞的辐射敏感性以0、1、3、5、7Gy的γ射线照射Chang氏肝细胞(wtp53)、HepG2细胞(wtp53)、PLC细胞(mtp53)和Hep3B(null p53)细胞,用细胞计数法检测受到不同剂量γ射线照射后的增殖变化情况。同时,用细胞分裂阻滞法(CB法)检测上述几种细胞的微核发生率。部分HepG2细胞、PLC细胞样品以20μmol/L的p53抑制剂pifithrin-α(PFT-α)进行预处理,检测PFT-α对细胞微核发生率的影响。2.p53与受辐射肝癌细胞所诱导旁效应的关系以0、1、3、5Gy的γ射线照射HepG2细胞、PLC细胞和Hep3B细胞,然后与未受照射的Chang氏肝细胞及自身肿瘤细胞共培养12h,用CB法检测未受照射的Chang氏肝细胞及肿瘤细胞的微核发生率随靶细胞受辐射剂量的变化。以3Gy照射上述三株细胞,并分别与未受照射的Chang氏肝细胞及自身肿瘤细胞共培养4h、12h、24h,检测旁细胞中微核发生率随时间的变化情况。用western blot法检测0、1、3、5Gy照射的HepG2细胞和与其共培养的Chang氏肝细胞中P53磷酸化蛋白随剂量的变化;同时检测3Gy照射的HepG2细胞及与其共培养的Chang氏肝细胞在共培养0、1、2、4、8、12、24h后P53磷酸化蛋白的表达情况。以实时定量荧光PCR法检测与受照射HepG2细胞共培养12h后Chang氏肝细胞p53 mRNA的表达。以20μmol/L的PFT-α预处理HepG2细胞和PLC细胞后再进行照射,然后与未受照射的Chang氏肝细胞或自身肿瘤细胞共培养,并以0.1%DMSO为PFT-α的对照,用CB法检测旁细胞的微核发生率,观察p53对细胞辐射损伤的调控作用;同时,用western blot法检测旁细胞中P53蛋白和P21蛋白的表达情况,评估p53抑制剂的作用效果。结果1.p53对肝癌细胞辐射敏感性的影响不同p53状态肝癌细胞及Chang氏肝细胞受辐射后其辐射敏感性不同:细胞增殖变化情况表明,p53缺陷型的Hep3B细胞具有最高的辐射敏感性,而具有野生型p53的肝癌细胞HepG2的辐射敏感性高于突变型p53细胞PLC。在高剂量区,Chang氏肝细胞与HepG2的辐射敏感性相似。CB法微核检测结果表明,具有野生型p53的HepG2细胞的微核形成率最高,Chang氏肝细胞的稍低,突变型p53的PLC细胞的次之,但p53缺失的Hep3B细胞不易产生微核。PFT-α可以大幅降低电离辐射对HepG2细胞和PLC细胞的损伤,且它对野生型p53细胞的辐射效应的影响比对突变型细胞的影响更加显著。2.p53与肝癌细胞辐射旁效应的关系肝癌细胞辐射诱导旁效应与p53状态亦密切相关,仅野生型p53肝癌细胞HepG2对旁细胞(Chang氏肝细胞和HepG2细胞)具有旁效应,引起旁细胞微核的形成,且该旁效应具有明显的剂量效应和时间效应;而PLC和Hep3B肝癌细胞几乎不能诱导辐射旁效应的产生。另外,p53抑制剂可显著抑制辐射旁效应的产生。Western blot实验结果表明,受辐射靶细胞HepG2与未受辐射旁细胞(Chang氏肝细胞)中P53磷酸化蛋白的表达存在明显的剂量效应和时间效应。剂量关系上,随辐照剂量的增加,靶细胞和旁效应中的P53蛋白表达增高,3Gy最高,剂量增加至5Gy时蛋白表达下降。时间上,靶细胞受照后1h或旁细胞与其共培养1h后,P53磷酸化蛋白表达开始增高,靶细胞2-4h达到高峰,旁细胞在2-8h时达到高峰,此后开始逐渐降低。实时定量PCR结果表明,旁细胞中p53 mRNA没有变化,说明P53蛋白表达的变化是转录后修饰的结果。结论1.肝癌细胞的辐射敏感性与p53状态有关,p53缺陷型的Hep3B细胞具有最高的辐射敏感性,而具有野生型p53的肝癌细胞HepG2的辐射敏感性高于突变型p53细胞PLC。2.具有野生型p53的HepG2细胞受照射后可以对正常肝细胞和肝癌细胞引起旁效应损伤,而突变型p53的PLC细胞和p53缺失的Hep3B细胞均不能诱导辐射旁效应。3.受辐照HepG2细胞及与其共培养的Chang氏肝旁细胞中磷酸化P53蛋白的表达与辐射剂量和处理后时间相关。4.肝癌细胞的辐射敏感性、受辐射肝癌细胞所诱导的旁效应均受到p53的调控。