大蓟为菊科植物蓟Cirsium japonicum DC.的干燥地上部分或根,是一味临床常用的止血药,在全国范围内均有广泛应用。大蓟用于临床常常炒炭止血,研究表明大蓟炒炭后止血作用增强,但由于炒炭后止血成分柳穿鱼叶苷含量下降,无法合理解释其炮制增效的机理,为解决这一问题,我们在本篇论文中进行了以下实验研究。目的：(1)优选实验原药材,比较不同产地大蓟炭止血药效与化学成分差异。(2)对大蓟炭的化学成分进行研究,阐明大蓟炒炭后的主要成分变化,揭示其转化机理。(3)建立实验所需动物出血模型,研究大蓟炭止血作用机制,筛选大蓟炭止血活性部位；对柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素的止血药效差异,及其作用机制进行研究；对柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素大鼠小肠吸收情况进行研究,比较其吸收差异。对柳穿鱼黄素大鼠小肠代谢产物进行分析。(4)研究不同地区大蓟炭柳穿鱼黄素含量；响应面法研究大蓟炭炮制工艺；研究大孔树脂提取、纯化柳穿鱼叶苷工艺条件；研究大蓟炒炭对其微量元素含量变化的影响。方法：(1)采用小鼠断尾法和玻片法测定了不同产地大蓟炭的止血药效、利用HPLC对不同地区生大蓟、大蓟炭成分差异进行比较。(2)采用系统提取分离法、结合正反相柱层析、大孔树脂吸附柱层析、Sephadex LH-20等分离手段,利用质谱、核磁共振分析方法对大蓟炭成分进行分离、纯化、鉴定。利用HPLC分析大蓟炒炭后变化的主要成分。(3)利用中医热药(附子、干姜)、干酵母、西医抗凝药物肝素钠与华法林制作小鼠出血模型,采用断尾法、毛细管法评价出血模型,比较大蓟炭对不同方法制作的出血模型小鼠出血、凝血时间的影响；系统溶剂萃取法分离大蓟不同极性部位,结合小鼠断尾法、毛细管法研究大蓟炭止血活性部位；采用小鼠断尾法、毛细管法、大鼠血凝四项、大鼠血小板CD62P阳性表达率等方法评价比较柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素的止血药效差异；采用大鼠小肠外翻肠囊法、大鼠在体原位灌注法研究柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素吸收机制,利用HPLC比较分析其吸收代谢产物；体外酶水解,结合LC-MS分析柳穿鱼黄素大鼠小肠吸收、代谢产物。(4)采用HPLC比较不同产地大蓟炭柳穿鱼黄素含量；根据中心组合试验设计原理(Box-Benhnken),采用响应面分析方法研究大蓟炭炮制工艺条件；结合HPLC法,对XAD-16吸附大孔树脂分离、纯化水相部位柳穿鱼叶苷的工艺进行研究；利用微波消解-ICP-OES接合的方法,研究大蓟炒炭对其微量元素变化的影响。结果：(1)不同产地的大蓟炭确实存在较大的止血作用差异,江西樟树、湖南地区产大蓟炭的止血作用最强,河北产大蓟炭也表现出一定的止血药效,安徽产大蓟炭则没有止血作用。HPLC分析显示,各地大蓟成分差异较大,相同成分含量亦存在较大差异。(2)从大蓟炭中共分离得到14个单体化合物,并分别进行了结构鉴定,14个化合物分别是柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素、蒙花苷、刺槐素、邻苯二甲酸二丁酯、3-羟基-4-甲基苯甲酸、5-羟基-7,4’.二甲氧基黄酮醇、3.羟基苯甲酸、芹菜素-7-O-β.D.葡萄糖醛酸苷、3-羟基.4.乙基苯甲酸、粗毛豚草素葡萄糖醛酸苷、5,7-二羟基-4’-甲氧基黄酮-7-0-β-D-葡萄糖苷、5-羟基.6,4’-二甲氧基黄酮.7.O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素。其中,四个化合物为植物首发,分别是5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮醇、芹菜素.7-0.β-D-葡萄糖醛酸苷、粗毛豚草素葡萄糖醛酸苷、5-羟基.6,4’-二甲氧基黄酮.7-0.β-D-葡萄糖苷。大蓟在制炭后,其蒙花苷、柳穿鱼叶苷的峰面积会明显减少,而出现的两个新成分峰,分别为刺槐素与柳穿鱼黄素,结合四个成分的化学结构,推断两个新成分是由生大蓟在制炭过程中,蒙花苷与柳穿鱼叶苷水解脱去双糖后生成的黄酮苷元。(3)中药热药、肝素钠、华法林均能造成动物出血时间的延长(P<0.05),干酵母有延长小鼠出血、凝血时间趋势,但不具统计学意义P>0.05。对各种动物出血模型,大蓟炭均显示出良好的止血效果,其止血机制可能与其能凉血止血、拮抗肝素钠对凝血酶的抑制以及类维生素K等作用有关。大蓟炭氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取部位均显示出较强止血药效。柳穿鱼黄素、柳穿鱼叶苷对肝素钠制作的小鼠出血模型均有明显的促凝血、止血作用,具统计学意义(P<0.05)；柳穿鱼黄素中、高剂量的止血活性要优于柳穿鱼叶苷(P<0.05)；柳穿鱼黄素止血药效与剂量存在一定的相关性,而柳穿鱼叶苷止血药效与剂量相关性不明显。大鼠血凝四项实验显示柳穿鱼黄素、柳穿鱼叶苷能显著升高大鼠FIB值(P<0.05),高剂量的柳穿鱼黄素对大鼠APTT值具有明显的减少趋势(P>0.05),但无统计学意义,提示柳穿鱼黄素、柳穿鱼叶苷止血活性可能是通过增加机体纤维蛋白原的含量,影响纤溶与抗凝系统而发挥作用；同时,柳穿鱼黄素可能具有增加内源性途径中凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ或Ⅻ活性的作用。大鼠活化血小板CD62P实验表明,柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素均具能显著增加大鼠血小板CD62P阳性表达率(P<0.05)；柳穿鱼黄素具有更强的活化大鼠血小板的作用,尤其是柳穿鱼黄素高剂量,其CD62P阳性表达率高于低剂量组的柳穿鱼叶苷、低剂量组的柳穿鱼黄素,甚至高于阳性药云南白药组(P均<0.05),显示出极强的血小板活化能力。实验结果还表明,柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素活化大鼠血小板CD62P阳性表达率的作用具有明显的剂量正相关性。大鼠小肠外翻肠囊实验证明柳穿鱼叶苷、柳穿鱼黄素在十二指肠、空肠、回肠,结肠段的吸收符合零级动力学特点,空肠与回肠是两药在体内主要吸收场所,其吸收情况好于十二指肠与结肠。柳穿鱼叶苷在整个小肠段的吸收率要明显大于其苷元柳穿鱼黄素,但由于柳穿鱼黄素在大鼠小肠内发生了明显的生物转化,该实验结果并不能真实反映两成分的吸收率。大鼠单向肠灌流法表明柳穿鱼黄素更易被大鼠小肠吸收,其吸收速率常数要明显大于柳穿鱼叶苷(P<0.01)；柳穿鱼黄素的肠流出液HPLC图和血浆HPLC图中均可以发现多个未知代谢成分,柳穿鱼叶苷肠流出液HPLC图和血浆HPLC图则显示该成分主要以原型形式吸收。体外酶水解结果显示,柳穿鱼黄素在小肠与血浆中发生了明显的葡萄糖醛酸化反应,LC-MS显示新产生的成分可能为柳穿鱼黄素葡萄糖苷、其甲基化产物与代谢产物。(4)不同地区柳穿鱼黄素含量差异较大,部分地区(河北、安徽)大蓟炭并不含柳穿鱼黄素,樟树与浙江产大蓟炭中柳穿鱼黄素含量最高,达到0.22%大蓟炭炮制工艺的最佳条件为投药量165g、炮制温度310℃、炮制时间13min。大蓟炭提取液上样质量浓度为0.077g/mL时,溶液最佳上样量为28BV,吸附流速为3BV/h,除杂溶剂为水,除杂体积为19BV,解吸液为50%乙醇,解吸液用量为12BV,解吸附流速为2BV/h。经此工艺纯化的大蓟炭样品,其所含的柳穿鱼叶苷成分质量分数可达到68%以上。大蓟炭中微量元素含量差异较大,其中Ca、K离子含量最高达到30mg/g以上,Fe、Mg、Mn的含量次之,Zn、Na、Cu的含量最少,含量低于0.1mg/g。大蓟炒炭后,各微量元素含量比生品大蓟均有不同程度升高；结论：大蓟炒炭止血增效的炮制机理与大蓟炒炭后,柳穿鱼叶苷水解生成止血作用更强的柳穿鱼黄素存在关联,且两活性单体成分的止血药效差异可能与其体内截然不同的吸收、代谢途径有关,仍值得进一步研究。同时,中药止血往往并非单一成分引起,炒炭过程中生成炭素、鞣质、游离Ca离子浓度均能影响其止血药效,制炭过程应同步考虑这些影响因素。论文主要创新点：①大蓟品种来源较为混杂,本文首先对不同地区大蓟止血药效及成分差异做了研究,优选了药材品种,一定程度上对本课题的顺利实施提供了保障。②对大蓟炭化学成分进行了提取、分离、共分离得到14个化合物,其中四个黄酮类化合物为大蓟中首发,并在此基础上,对大蓟炒炭变化的主要化学成分的转化机理进行了阐述。③首次对大蓟炭柳穿鱼黄素、柳穿鱼叶苷的止血药效及其止血作用机制进行了较为全面的研究,证明了两成分的止血作用,发现了两成分之间的止血药效差异与止血作用机制。为揭示大蓟炒炭止血增效的炮制机理提供了数据支持。④学术思想上,较为创新的提出了柳穿鱼黄素、柳穿鱼叶苷的止血药效差异与其体内吸收难易是否关联这么一个科学假设。并在对柳穿鱼黄素、柳穿鱼叶苷大鼠在体、离体肠吸收实验中发现,两成分吸收差异明显,并且在大鼠体内存在明显不同的生物代谢途径。进一步结合体外酶水解与LC-MS技术,我们首次对柳穿鱼黄素大鼠体内代谢产物进行了结构分析,推测了其可能的化学结构。这些研究都为大蓟炭柳穿鱼黄素药理活性进一步研究提供了理论依据。