纤维素是由葡萄糖单元通过β-(1,4)糖苷键聚合而成的大分子多糖,是植物和藻类利用光能和二氧化碳进行光合作用的产物。作为植物细胞壁的主要组份,纤维素是地球上含量最丰富的碳水化合物之一。因此,其生物降解不仅构成了自然界碳循环的重要环节,而且也是生物质燃料及大宗生物基产品生产的重要原料。在自然界中存在着众多具有纤维素降解能力的微生物,丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中的杰出代表。里氏木霉是一种十分高效的纤维素降解真菌,在纤维素存在的条件下,能迅速做出响应诱导表达大量的纤维素酶基因,以实现对纤维素的高效降解。由于其具备强大的纤维素酶表达能力,因此被开发为重要的纤维素酶工业生产菌株,在生物能源生产领域具有十分重要的价值和地位。虽然经过数十年的诱变育种和研究,已经获得了多个里氏木霉纤维素酶高产菌株,其产酶性能也得到了极大的提高。但是目前纤维素酶的高成本依然是制约生物能源及大宗生物基产品工业化生产的一个瓶颈。因此进一步提升里氏木霉纤维素酶的表达水平和水解效率是解决该问题的根本。经过几十年的研究,人们对里氏木霉纤维素酶系的组成、理化性质、水解纤维素的作用机制等均有了较为深入的研究和认识,并且在里氏木霉中也鉴定了多个参与纤维素酶基因表达调控的转录因子,其中包括转录激活因子Xyr1。虽然遗传学分析表明Xyr1控制着几乎所有的纤维素酶基因和半纤维素酶基因的诱导表达,但Xyr1如何激活纤维素酶基因表达的具体作用机制目前尚不清楚。因此,对Xyr1作用机制的深入研究不仅能够使我们更深入地了解里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达调控机制,而且可以为里氏木霉菌株的遗传改良和进一步提高纤维素酶工业生产水平提供理论支持。本论文的研究工作围绕Xyr1如何启动纤维素酶基因表达这一问题展开,以Xyr1相互作用蛋白为切入点,同时对可能参与Xyr1转录激活过程的两个复合物的重要亚基的功能进行了深入研究。主要研究结果如下:1.通过酵母双杂交筛选,鉴定了一个新的Xyr1相互作用蛋白MATa1。对其功能研究发现,MATa1参与光照下的纤维素酶基因诱导表达调控,并且以依赖Xyr1的方式被募集至纤维素酶基因启动子区参与Xyr1对纤维素酶基因表达的调控。为了鉴定参与Xyr1调控纤维素酶基因表达过程的辅因子,我们构建了里氏木霉cDNA表达文库,并通过酵母双杂交筛选获得了一个注释为接合型座位转录因子(mating tpye locus transcription factor)MATa1。细胞定位分析表明,MATa1和Xyr1共定位于细胞核中。通过构建mata1基因敲除菌并分析其纤维素酶诱导表达情况发现,MATa1缺失会降低光照条件下纤维素酶的诱导表达水平,而在黑暗条件下则几乎不影响纤维素酶的表达。与敲除菌株表型相反,MATa1过表达菌株中的纤维素酶诱导受到明显的抑制,暗示过高的胞内MATa1水平可能会干扰Xyr1的功能。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)分析发现,MATa1只有在纤维素诱导条件下才可结合到纤维素酶基因启动子区,而其对信息素前体基因hpp1和信息素受体基因hpr2启动子区的结合则不受碳源的影响。进一步研究发现,在Xyr1缺失背景下,MATa1无法结合纤维素酶基因启动子,表明MATa1在诱导下与纤维素酶基因启动子的结合依赖于转录因子Xyr1。综上所述,我们通过筛选相互作用蛋白的方法并结合体内功能研究鉴定了一个Xyr1相互作用蛋白MATa1,并发现其以Xyr1依赖的方式被招募至纤维素酶基因启动子区参与纤维素酶基因诱导表达调控。2.发现里氏木霉乙酰转移酶复合物GCN5/ADA2/ADA3在纤维素酶基因诱导表达过程中发挥重要作用。真核生物中,组蛋白乙酰化修饰通常与基因的转录激活相关。本课题组前期鉴了里氏木霉乙酰转移酶GCN5并发现其对于纤维素酶基因诱导表达十分关键。然而GCN5的缺失会对菌体造成很大的影响,如严重影响生长、生孢等基本生命活动,也不便于后续遗传操作和菌种保藏。为了解决这一问题,本研究构建了一个基于铜离子响应、可控表达的启动子置换系统,即通过一步同源双交换的方法将目的基因的启动子置换为铜离子响应的tcu1启动子,通过外源添加铜离子来实现对目的基因表达的控制。通过构建GCN5的启动子置换菌株并进行分析发现,加入铜离子关闭表达呈现与缺失菌一样的表型,这表明该系统是成功的。我们进一步通过生物信息学的方法鉴定了乙酰转移酶复合物的另外两个亚基,Ada2和Ada3,并利用该系统对两者的功能进行了研究。结果发现,关闭Ada2的表达导致纤维素酶诱导表达受到十分严重的影响,说明Ada2在纤维素酶基因表达过程中发挥十分重要的作用。同样地,关闭Ada3的表达对生长造成较大影响,同时也导致纤维素酶表达水平明显下调。综上所述,GCN5/Ada2/Ada3乙酰转移酶复合物参与里氏木霉生长、生孢和纤维素酶表达等生理学过程并在其中发挥着十分重要的作用。3.Xyr1通过靶向募集组蛋白乙酿转移酶复合物至纤维素酶基因启动子区调控纤维素酶基因表达。通过ChIP分析发现,在纤维素诱导下,纤维素酶基因启动子区的H3K9、H3K14乙酰化修饰同时依赖于GCN5和Xyr1,暗示两者在功能上存在一定程度的关联。通过酵母双杂交分析发现Xyr1与GCN5和Ada3存在相互作用。通过构建ProA-GCN5重组菌株并进行ChIP分析发现,在纤维素诱导下,GCN5能被招募至纤维素酶基因启动子区。进一步分析发现,在Xyr1过表达背景下,即使在非诱导条件,GCN5也能被招募至纤维素酶基因启动子区。由此可见Xyr1很可能通过靶向募集GCN5/Ada2/Ada3乙酰转移酶复合物来介导纤维素酶基因启动子区进行乙酰化修饰促进纤维素酶基因的表达。然而对OExyr1_Ptcu1-gcn5菌株的表型进行分析发现,在Xyr1过表达条件下,无论在诱导下还是非诱导下,关闭GCN5的表达并不影响纤维素酶基因的表达。由此可见,当Xyr1过量表达的情况下,可以摆脱对GCN5的依赖。综上所述,在里氏木霉纤维素酶基因诱导表达过程中,GCN5一方面调控Xyr1的表达,另一方面在纤维素诱导下,表达出来的Xyr1会招募GCN5复合物对纤维素酶基因启动子区进行乙酰化修饰,进一步促进纤维素酶基因的表达。因此,Xyr1表达水平的调控是纤维素酶基因转录表达的一个重要开关。4.发现里氏木霉Mediator复合物Gal11亚基差异调控纤维素酶基因的诱导表达。在真核生物基因表达过程中,Mediator复合物在基因的转录激活过程中发挥着十分重要的作用,其中尾部模块(Tail module)的Gal11是很多转录激活激活因子结合的靶标。我们通过生物信息学方法鉴定了里氏木霉Mediator复合物亚基的Gal11亚基。通过构建gal11缺失突变体并对其表型进行分析发现,Gal11缺失并不影响菌体在固体和液体培养基中的生长和对多种碳源的利用,但是Gal11缺失突变株基本不产生分生孢子,并且不再产生色素,表明Gal11对于有性生殖和次级代谢具有非常重要的调控作用。对纤维素诱导下的突变体表型进行分析发现,Gal11缺失导致胞外的内切纤维素酶和外切纤维素酶酶活均大幅度降低,但β-葡萄糖苷酶基因的表达并不受Gal11缺失的影响。进一步的转录分析结果表明,上述差异调控现象发生在转录水平,并且Gal11缺失会导致xyr1的转录水平急剧降低。综合上述研究,我们发现里氏木霉Gal11在分生孢子形成、次级代谢过程发挥十分关键的作用,并且差异调控纤维素酶基因的诱导表达,其对外切纤维素酶和内切纤维素酶基因的充分诱导表达是必须的,但不参与β-葡萄糖苷酶基因的诱导表达。5.Gal11通过参与对RNA聚合酶 Ⅱ的募集和影响Xyr1的稳定性来调控纤维素酶基因表达。通过染色质免疫共沉淀技术对Gal11缺失菌中纤维素酶基因启动子调控区的相关因子的募集分析发现,Gal11的缺失导致外切纤维素酶基因和内切纤维素酶基因核心启动子区RNA聚合酶Ⅱ的募集水平急剧降低,然而β-葡萄糖苷酶基因核心启动子区的结合水平则不受影响。进一步分析发现,Gal11缺失后,虽然xyr1转录水平显著降低,但纤维素酶启动子区的Xyr1结合水平反而高于对照菌株,由此可见Gal11缺失导致结合于启动子调控区的Xyr1更加稳定。在Xyr1过表达菌株中缺失Gal11并分析其表型发现,Xyr1的过表达并不能恢复Gal11缺失造成的纤维素酶下调效应。对该菌株在非诱导条件下的表型进行分析发现,Xyr1过表达菌株在缺失Gal11后在葡萄糖培养基中同样几乎无法启动纤维素酶基因的表达。ChIP分析发现,在此条件下,该菌株中Xyr1在纤维素酶基因启动子区的结合水平也要高于出发菌株OExyr1,而RNA聚合酶Ⅱ的募集水平却急剧降低。由此可见,Gal11对于过表达Xyr1菌株在非诱导下高水平激活纤维素酶基因表达是必须的。综合上述结果,我们发现,Gal11在里氏木霉纤维素酶基因的完全诱导表达过程中发挥重要作用,这种作用很大程度上是通过影响RNA PolⅡ的募集来实现的,并且Gal1对Xyr1在启动子上的结合水平具有重要的调控作用,在过表达Xyr1所介导的非诱导条件下纤维素酶基因的高水平表达是必须的。6.过表达Xyr1导致纤维素酶基因非诱导依赖的差异化表达。通过转录组测序分析发现过表达Xyr1在非诱导条件下可激活绝大多数的纤维素酶和半纤维素酶基因的表达,同时也造成占全基因组约40%基因的表达下调,其中包括很多基础代谢途径的基因。我们之前研究发现,在里氏木霉中过表达Xyr1会造成纤维素酶组成型高水平表达。本研究在里氏木霉QM9414Axyr1菌株中构建了定点过表达Xyr1的菌株(OExyr1)。该菌株在葡萄糖培养基中的纤维素酶表达速率和总酶活水平均要高于QM9414在诱导下的水平。进一步分析发现,相比较于内切纤维素酶和外切纤维素酶的表达,过表达Xyr1对β-葡萄糖苷酶的激活作用较弱,要显著低于QM9414在诱导条件下的水平。通过染色质免疫共沉淀技术分析发现,在非诱导条件下,过表达Xyr1会导致纤维素酶基因启动子区的核小体占据水平急剧降低,这种核小体丢失的现象在野生型纤维素酶基因诱导表达过程中也同样存在。关闭Xyr1表达后则又能恢复到野生型的水平。这一结果表明Xyr1在激活纤维素酶基因表达过程中的伴随的一个重要事件便是对核小体进行重排和染色质结构进行调控使之变得更为开放。为了进一步分析过表达Xyr1对整个基因组基因表达谱式的影响,我们对该菌株在葡萄糖条件下以及QM9414对照菌株在纤维素诱导与葡萄糖非诱导下的转录本样品进行了转录组测序(RNA-Seq)分析。结果表明,在葡萄糖培养条件下,Xyr1过表达菌株下相比QM9414有589个基因表达上调,3637个基因表达下调;在纤维素诱导条件下,QM9414分别有897和1012个基因表达上调或下调。进行聚类分析发现,两个菌株中有334个基因上调基因重叠,其中包括绝大多数的纤维素酶基因和半纤维素酶基因,而参与诱导下纤维素酶基因表达调控的转录因子包括Ace2、Ace3、Clr1、Clr2等,在Xyr1过表达菌株中几乎均未呈现出表达上调现象。由此可见,单独过表达转录因子Xyr1可能便足以启动纤维素酶系基因和半纤维素酶系基因的表达。在QM9414菌株中大多数纤维素诱导表达上调的转运蛋白在OExyrl菌株中均未呈现上调趋势,包括对纤维素酶诱导表达所必须的一个主要协助转运超家族(major facilitator superfamily,MFS)转运蛋白Crt1,这表明Xyr1的过表达可以在某种程度上绕过上游的碳源感应和传导信号途径启动纤维素酶表达。在蛋白折叠分泌途径中发挥重要作用的一些基因如Bip1、Pdi1/2/3、Cne1等,在OExyr1菌株中的表达水平发生明显上调,并且要高于QM9414在诱导下的水平,可见Xyr1的过表达也促进了菌体对纤维素酶的折叠分泌。综合上述转录组数据分析结果可知,在里氏木霉中单独过表达Xyr1在很大程度上摆脱了野生型中纤维素酶基因诱导表达过程中对上游诱导碳源转运和信号传导以及对其他转录因子作用的依赖,并且一定程度上促进了蛋白折叠分泌途径相关蛋白的表达,使该菌株适应持续高水平表达的纤维素酶基因并将胞内大量合成的纤维素酶分泌至胞外。