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背景法尼醇X受体(Farnesoid X receptor,FXR)是核受体超家族中的一员,主要表达于肝脏、肾上腺、小肠等器官。FXR作为一种代谢调节基因,与胆汁酸、胆固醇、脂肪、葡萄糖等物质代谢密切相关,并在肠道细菌生长及肝再生中起着重要作用。目前研究发现,FXR激动剂通过激活FXR上调小异质二聚体伴侣(Small heterodimer partner,SHP)的表达,SHP与肝受体同源物-1结合并使其失活,从而抑制胆固醇合成胆汁酸的限速酶胆固醇7α-羟化酶(Cholesterol 7α-hydroxylas,CYP7A1)的表达,减少胆汁酸的合成减轻胆汁淤积性肝病,FXR激活诱导SHP表达可以通过抑制肝X受体减少脂肪的合成从而缓解非酒精性脂肪肝病的脂肪变性。FXR拮抗剂可以通过抑制FXR与过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α启动子的结合调节糖异生并改善2型糖尿病小鼠的葡萄糖稳态。目前发现的FXR拮抗剂多为甾体类化合物,该类结构与类固醇激素结构相近,易引起脱靶效应,从而导致较大的副作用,因此发现新型非甾体类FXR拮抗剂具有十分重要的意义。针对对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)引起的急性肝衰竭目前无特效药物,而FXR的靶基因SHP可以调节APAP代谢为有毒物质NAPQI的关键酶CYP2E1的表达水平,因此FXR拮抗剂具有潜在治疗APAP引起的急性肝衰竭的临床价值。目的本论文借助计算机辅助药物设计手段、经药效团构建、虚拟筛选及活性测试发现FXR拮抗剂并研究其下调SHP表达水平后是否可以缓解APAP引起的肝衰竭。方法1.借助计算机辅助药物设计手段,构建基于共同特征的药效团模型及分子对接模型,对化合物库进行虚拟筛选。2.通过均相时间分辨荧光(HTRF),在分子水平筛选具有FXR拮抗活性的化合物。3.将HepG2细胞接种于培养板中,分别加入2μM化合物,处理时间为24 h,RT-PCR检测FXR靶基因SHP及CYP7A1mRNA表达水平的变化,验证化合物在细胞水平是否具有FXR拮抗活性。4.通过HTRF验证GSK2118436(6号化合物)是否具有浓度依赖性FXR拮抗活性。5.在HepG2细胞加入FXR激动剂GW4064及6号化合物,选用RT-PCR及双荧光素报告基因实验检测6号化合物是否具有拮抗GW4064对FXR的激动活性。6.将HepG2细胞接种于培养板中,按实验分组分为6号化合物量效关系组和时效关系组,RT-PCR检测FXR靶基因SHP mRNA表达水平的变化。7.我们对6-8周的昆明鼠雄鼠进行腹腔注射6号化合物30 mg/Kg,分别于不同时间处死小鼠。将部分小鼠肝脏组织破碎后提取总mRNA,RT-PCR进行检测SHP mRNA表达水平的变化。8.在HepG2细胞加入6号化合物2 μM,处理24 h后,选用RT-PCR检测FXR相关基因mRNA表达水平的变化,以及药物代谢相关基因CYP2C19、CYP2E1、CYP2C9的mRNA表达水平的变化。选用Western blot检测SHP蛋白表达水平的变化。9.选取6-8周野生C57L/6J雄性小鼠适应性喂养1周后用于实验,将其随机分为三组:正常对照组、APAP组、6号化合物联合APAP组,眼球取血4℃静置20 min后离心取血清测ALT、AST水平。处死小鼠后4%多聚甲醛固定保存部分肝组织做HE染色。结果1.构建药效团模型进行虚拟筛选(1)从文献、专利中从中挑选出6个化合物作为训练集分子,采用Discovery Studio 3.0软件构建FXR配体的药效团模型。最终计算得到10个药效团模型。根据Rank评分,模型01被选为最佳药效团模型。(2)我们利用课题组已有的化合物库采用DS3.0软件中Ligand Profiler模块进行虚拟筛选,得到12个化合物进行手动筛选。2.体外活性测试(1)HTRF筛选得到6号、7号化合物在分子水平具有FXR拮抗活性,其中6号化合物呈浓度依赖性FXR拮抗活性,并且在同样浓度下与GS相比活性更强。(2)6号化合物预处理降低HepG2细胞中SHP mRNA表达水平并升高CYP7A1 mRNA表达水平。(3)RT-PCR和双荧光素报告基因结果显示6号化合物在细胞水平降低GW4064对FXR的激动活性。(4)RT-PCR结果显示6号化合物呈时间依赖性和浓度依赖性降低HepG2细胞中SHP mRNA表达水平,明显降低HepG2细胞中药物代谢酶CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1的mRNA表达水平,上调OATPC、BSEP、FXR的mRNA表达水平,(5)Western blot结果显示6号化合物预处理下调HepG2细胞中SHP的蛋白表达水平。3.体内活性测试(1)6号化合物呈时间依赖性降低昆明小鼠肝脏中SHP mRNA表达水平。并且下调肝脏CYP1A2、CYP2E1的mRNA表达水平。(2)6号化合物预处理明显降低APAP引起的小鼠血清AST水平升高,从而减轻了 APAP引起的肝细胞坏死。结论1.构建药效团模型进行虚拟筛选得到12个可能具有FXR拮抗活性的化合物,经均相时间分辨荧光实验筛选出6号化合物和7号化合物在分子水平具有FXR特异性拮抗活性,RT-PCR进一步验证显示只有6号化合物在细胞水平具有FXR拮抗活性。并且6号化合物在分子水平、细胞水平具有浓度依赖性FXR拮抗活性,在细胞水平、动物水平具有时间依赖性FXR拮抗活性。2.6号化合物通过拮抗FXR活性下调其靶基因SHP基因和蛋白的表达水平,从而降低APAP代谢为有毒物质NAPQI的关键酶CYP2E1的表达水平以改善APAP引起的野生小鼠急性肝衰竭。