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无乳链球菌是养殖鱼类链球菌病的重要病原之一,可引起鱼类游动异样、败血症、脑膜炎和突眼等症状,给鱼类养殖业带来严重的经济损失。目前无乳链球菌的研究多集中在人类领域,针对鱼源无乳链球菌致病机理了解甚少。细菌的双组分信号转导系统(two-component signal transduction system,TCS)能够感应外界环境变化,并将信号传递到细胞内,引起细菌作出相应应答调控,其在细菌适应宿主体内微环境变化的调控方面发挥重要作用。前人研究表明,phoB基因作为双组分系统PhoBR的反应调控因子(Response regulator),既参与细菌无机磷浓度调节,又负责调控生物膜形成以及多种毒力因子/蛋白表达。而关于无乳链球菌PhoB的相关功能研究在国内外尚属空白。因此,本研究以分离于卵形鲳鲹的无乳链球菌TOS01强毒株为野生株,利用同源重组技术,构建无乳链球菌phoB基因缺失突变株SAΔphoB,并通过转录组和蛋白组学研究无乳链球菌PhoB对生物膜形成和毒力相关基因的调控,利用lac Z报告基因和细菌单杂交方法验证其对溶血素的调控功能,阐明PhoB对毒力基因的调控作用。主要研究结果和结论如下:1.海水养殖卵形鲳鲹链球菌的分离鉴定2012-2014年,从北海、湛江和深圳患病卵形鲳鲹中分离到9株链球菌TOS01-TOS09,其中TOS01和TOS06为共感染菌株。结合生理生化方法和分子生物学技术鉴定TOS01-05为无乳链球菌、TOS06-08为海豚链球菌和TOS09为停乳链球菌停乳亚种。半致死量LD50测定结果显示,无乳链球菌TOS01的LD50(6.38×104 CFU)较海豚链球菌TOS06(1.47×107 CFU)和停乳链球菌停乳亚种TOS09(2.57×106 CFU)高,并且所有菌株对头孢拉定、头孢噻肟和红霉素极度敏感。2.无乳链球菌TOS01 phoB基因缺失株的构建及其生物学特性研究以无乳链球菌TOS01强毒株为野生株,扩增phoB上下游同源臂及红霉素基因,采用分段酶切连接方法将其连接到温敏型自杀质粒pSET4s载体上,利用同源重组技术,成功构建了无乳链球菌phoB基因缺失突变株SAΔphoB。同时利用大肠杆菌-革兰氏阳性穿梭质粒pDL276构建了互补株CΔphoB。分析突变株SAΔphoB生物学特性显示,SAΔphoB能够稳定遗传,但生长速率明显降低,链条由原来的两个或短链状变为几十个长链状排列,表面缺少野生态的凹凸不平胞外基质而变得较为光滑,静止期生物膜厚度显著高于TOS01和CΔphoB,溶血活性、细胞的侵入、黏附以及抗吞噬能力则低于TOS01和CΔphoB;使用卵形鲳鲹为模型比较了三种菌株的毒力,显示phoB缺失后导致细菌毒力明显下降;以低浓度突变株SAΔphoB免疫卵形鲳鲹获得高达93.1%相对免疫保护率,表明其可作为候选疫苗保护卵形鲳鲹免受无乳链球菌危害。3.PhoB对生物膜形成和毒力基因调控比较野生株TOS01和突变株SAΔphoB转录组和蛋白图谱,分别有521个基因和60个蛋白发生了差异表达,涉及磷酸转运系统、应激反应、碳水化合物、脂肪酸和氨基酸代谢、ABC转运系统以及毒力和生物膜形成方面,其中33个与毒力相关的基因和蛋白在限磷条件下受PhoB的调控表达,主要涉及无乳链球菌黏附、定植和入侵;12个与细胞生物膜相关,编码荚膜多糖的5个基因表达水平则下调,表明无乳链球菌的PhoB参与调控细菌生物膜形成和毒力基因表达。4.PhoB调控溶血素相关基因的功能验证通过构建lacZ报告基因载体和细菌单杂交方法检测了无乳链球菌PhoB对cyl、hemolysin III、hemolysin A和ciaR基因启动子区的结合作用。结果显示,PhoB可直接与hemolysin A和ciaR基因启动子区的结合,但未与cyl和hemolysin III基因启动子区的相结合,表明PhoB对其调控是间接的。通过构建18bp DNA随机片段文库法利用细菌单杂交系统发现PhoB结合的保守序列为TTGGAGAA(G/T)。