论文部分内容阅读
传统中药莪术具有破瘀行气、止痛消积的功效,常用于气滞血瘀导致的胸痹心痛、血滞经闭、癥瘕痞块及跌打损伤等症。史大卓教授认为动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）形成属于血脉癥瘕,临床实践中将莪术配伍益气活血之品运用于AS相关疾病,发现该类方药能够缓解相关临床症状,稳定斑块;前期研究发现莪术活性成分Zedoarondiol,具有缓解氧化应激导致的内皮细胞损伤,但Zedoarondiol能否在体内延缓AS斑块进展,降低斑块内炎症细胞负荷尚不明确。本文临床研究基于临床数据分析史大卓教授含莪术方剂治疗动脉粥样硬化相关疾病配伍规律,为临床研究提供思路;基础研究部分采用APOE基因缺陷小鼠联合细胞实验对Zedoarondiol调节炎症细胞跨内皮迁移效应及机制进行研究。临床研究:基于临床数据挖掘分析史大卓教授应用含莪术方剂治疗动脉粥样硬化相关疾病的配伍规律研究目的:基于临床数据挖掘理论对史大卓教授门诊治疗动脉粥样硬化相关疾病处方中含莪术的方剂进行分析,挖掘其配伍规律为使用莪术辨治动脉粥样硬化提供新思路。研究方法:收集史大卓教授门诊2019年6月至2021年3月治疗动脉粥样硬化相关疾病的处方,筛选出含有莪术的处方共220首,将诊断及用药信息导入中医传承辅助平台（V2.5）,依次点击相应功能按钮进行分析,内容包括药物频次统计、组方规律分析包括:聚类分析、提取组合、网络展示等。研究结果:通过频次统计,发现使用频次较高的药物有丹参、川芎、赤芍、红花、陈皮、黄芪、黄连、黄芩、茯苓;四气以温性为主,其次为寒性和平性;五味中以苦味、辛味、甘味为主;归经以肝、脾、心为主。在支持度为30%时,挖掘到常用核心药物组合共280个,其中2味药关联规则有41个,3味药关联规则78个,4味药关联规则86个,5味药关联规则有55条,6味药关联规则有18条,7味药关联规则有2条;当支持度设置为30%时,莪术与丹参、黄连、黄芪这三组配伍,核心组合相似较高,但支持度在10%及20%时外围药物种类具有较大差别。研究结论:史大卓教授在在治疗动脉粥样硬化时莪术常与活血化瘀药物丹参、红花等配伍增强活血化瘀之力,与补气药黄芪配伍达到补气以助行血的目的,与清热解毒药黄连配伍实现清解瘀毒而不凝滞的目的。实验研究:研究一 Zedoarondiol抗高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的研究研究目的:观察Zedoarondiol抗高脂饮食诱导ApoE-\-小鼠动脉粥样硬化的效应,通过NF-κB/黏附分子探讨相关机制。研究方法:8周龄载脂蛋白E（apolipoprotein E,ApoE）基因缺陷型小鼠40只,高脂饮食诱导形成AS模型。随机分为模型组,Zedoarondiol小剂量组,Zedoarondiol大剂量组,阿托伐他汀组。同时选取同源C57/BL小鼠10只作为空白组,普通饲料喂养。Zedoarondiol小剂量组小鼠给予Zedoarondiol lmg/kg/d,Zedoarondiol大剂量组给予Zedoarondiol 5mg/kg/d,阿托伐他汀组给予阿托伐他汀10mg/kg/d,模型组和空白组给予等体积生理盐水灌胃,持续12周。实验结束后,取血清及主动脉组织,使用生化法测定血脂,Elisa测定主动脉组织中炎症因子变化,主动脉根部切片进行油红O染色、改良Masson染色观察斑块大小及胶原蛋白含量变化,免疫荧光检测斑块内炎症细胞含量,Western Blot检测主动脉VCAM-1、ZO-1、NF-κB p52 蛋白表达情况,RT-qPCR 检测 VCAM-1 mRNA、ZO-1、NF-κB p52 转录情况。研究结果:与空白组相比模型组小鼠主动脉根部斑块面积明显增加（P＜0.01）,斑块内胶原蛋白含量明显减少（P＜0.01）,斑块内CD68+面积明显增加（P＜0.01）血清脂质总胆固醇,甘油三酯,低密度脂蛋白含量升高,低密度脂蛋白含量明显降低（P＜0.01）。血清NO含量、总SOD活力含量明显降低（P＜0.01）,MDA含量升高（P＜0.01）;主动脉组织中炎症细胞因子IL-6、MCP-1含量明显升高;扫描电镜结果显示:模型组小鼠内皮细胞裂隙增加（P＜0.01）,单核细胞及脂肪沉积明显增多（P＜0.01）;Western Blot结果显示模型组主动脉组织中NF-κBp52、VCAM-1表达升高（P＜0.01）,同时ZO-1水平有所下降。RT-qPCR结果显示模型组VCAM-1 mRNA转录水平升高,同时ZO-1 mRNA水平下降（P＜0.01）。与模型组相比,Zedoarondiol干预后小鼠主动脉根部切片油红O染色面积减少（P＜0.01）,斑块内部胶原蛋白含量增加（P＜0.01）,斑块内CD68阳性细胞数量减少（P＜0.01）。血清脂质检测结果Zedoarondiol干预后小鼠总胆固醇（P＜0.01）、低密度脂蛋白水平（P＜0.01）下降。血清一氧化氮含量、总SOD活力明显升高（P＜0.01）,MDA含量降低（P＜0.01）;主动脉组织中炎症细胞因子IL-6、MCP-1含量明显降低（P＜0.01）;扫描电镜结果显示:Zedoarondiol能够减小内皮细胞裂隙（P＜0.01）,降低单核细胞及脂肪沉积（P＜0.01）;Western Blot结果显示Zedoarondiol 干预后 NF-κB p52、VCAM-1 表达下降（P＜0.01）,同时 ZO-1 水平升高。RT-qPCR结果显示Zedoarondiol干预之后VCAM-1 mRNA转录水平下降,同时ZO-1 mRNA水平升高（P＜0.01）。研究结论:1.Zedoarondiol能够调节高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血脂代谢,减少动脉硬化斑块面积,保护血管内皮屏障功能,抑制炎症细胞黏附,减轻斑块内炎症细胞负荷。2.Zedoarondiol保护高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉内壁内皮细胞裂隙抑制单核细胞及脂肪沉积,其机制与NF-κB信号通路介导的黏附分子表达,及ZO-1蛋白表达有关。研究二Zedoarondiol通过保护内皮细胞功能、抑制炎症细胞跨内皮迁移的研究研究目的:观察Zedoarondiol减轻过氧化氢诱导的内皮细胞损伤,改善内皮细胞屏障功能障碍的效应,并通过caveolin-1/NF-κB/黏附分子信号通路探讨相关机制。研究方法:以200mM过氧化氢溶液刺激HUVECs 12h,建立内皮细胞损伤模型。采用细胞共培养的方法,使用激光共聚焦显微镜下观察Zedoarondiol抑制THP-1与内皮细胞黏附,Transwell实验观察Zedoarondiol抑制THP-1跨内皮迁移效应。鬼笔环肽标记细胞骨架,免疫荧光标识Cav-1,观察Zedoarondiol对细胞骨架重组的影响,Western Blot检测细胞间紧密结合蛋白NF-κB、Cav-1、VCAM-1、ZO-1、Cofilin 表达;RT-qPCR 检测 NF-κB mRNA、Cav-1 mRNA、VCAM-1 mRNA、Cofilin mRNA 转录水平。研究结果:与空白组相比,模型组单核细胞与HUVEC黏附增加（P＜0.01）,跨内皮迁移的单核细胞数量也增加（P＜0.01）。Transwell上室底部无HUVEC覆盖面积明显增大（P＜0.01）。细胞免疫荧光结果显示过氧化氢刺激后导致模型组Cav-1 高表达（P＜0.01）,Western Blot 结果显示模型组 NF-κB、Cav-1、VCAM-1表达升高ZO-1表达（P＜0.05）。RT-qPCR结果显示模型组NF-κB mRNA、Cav-1 mRNA、VCAM-1 mRNA转录水平升高,ZO-1 mRNA转录水平降低（P＜0.01）。与模型组相比,Zedoarondiol能够减少单核细胞与HUVEC黏附（P＜0.01）,减少跨内皮迁移的单核细胞数量（P＜0.01）。Transwell上室底部无HUVEC覆盖面积明显减少（P＜0.01）。细胞免疫荧光结果显示Zedoarondiol能够降低过氧化氢刺激导致的Cav-1高表达（P＜0.01）,Western Blot结果显示Zedoarondiol能够抑制 NF-κB、Cav-1、VCAM-1、Cofilin 表达,升高 ZO-1 表达（P＜0.05）。RT-qPCR 结果显示Zedoarondiol 能够抑制 NF-κB mRNA、Cav-1 mRNA、VCAM-1 mRNA、Cofilin mRNA 表达水平,提高 ZO-1 mRNA 表达（P＜0.01）。研究结论:Zedoarondiol能够减轻过氧化氢诱导的内皮细胞氧化应激损伤,保护血管内皮屏障功能,抑制炎症细胞与内皮细胞黏附及跨内皮迁移,其机制与caveolin-1/NF-κB/黏附分子信号通路VCAM-1及ZO-1表达有关。