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一、研究背景和目的白念珠菌（Candida albicans）是引起浅部、深部念珠菌病最常见的病原菌。它可引起不同程度的念珠菌病,从浅表黏膜感染到伴高死亡率的系统性疾病。血小板除了具有止血的功能,在感染和免疫中也发挥重要作用,特别是当它们被激活时。活化的血小板通过分泌抗菌效应分子、增强吞噬细胞抗菌能力、促进抗原提呈等方式直接或间接发挥抗病原微生物（细菌、病毒、真菌等）感染的作用。血小板被激活是其防御病原体感染的重要前提。血小板可通过模式识别受体（PRRs）、粘附受体GPⅡb/Ⅲa等受体识别微生物,激活细胞内信号通路,最终导致血小板活化。但关于血小板如何识别白念珠菌且是否可被白念珠菌激活继而发挥抗菌作用,尚未明确。单核细胞在防御系统性白念珠菌感染中发挥重要作用。血小板在某些细菌、真菌感染时,可通过增强单核细胞的吞噬作用及促炎因子分泌等方式而间接发挥抗菌作用。但关于血小板是否可增强单核细胞抗白念珠菌的免疫反应尚不清楚。本实验在上述研究背景下,旨在明确白念珠菌对血小板活化及抗菌效应分子分泌的影响及其作用机制;探索介导白念珠菌激活血小板的受体;初步探索血小板对单核细胞抗白念珠菌固有免疫反应的影响。二、实验方法1.白念珠菌活菌、热灭活白念珠菌与血小板共孵育后,流式细胞术（FACS）检测血小板表面活化标记物P-选择素（P-selectin）表达情况;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共孵育后上清液中PF-4、CCL5、TNF-α、CXCL8、IL-1β及β-defensin-2的分泌情况;免疫印迹（WB）检测共孵育后血小板中AKT、Stat-3、P38 MAPK及ERK1/2 MAPK磷酸化水平。2.用LY294002、MK2206分别抑制PI3K和AKT,探究抑制PI3K-AKT通路后,白念珠菌是否仍能活化血小板。WB检测AKT磷酸化的抑制效果;FACS检测P-selectin表达情况。3.FACS、WB、实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测白念珠菌与血小板共孵育后血小板TLR2、TLR4的表达水平。4.中和抗体封闭血小板表面TLR2及TLR4后,验证白念珠菌是否仍能活化血小板。采用FACS检测P-selectin表达情况。5.采用Pam3CSK4、FSL-1激活血小板TLR2,采用LPS激活血小板TLR4,探究TLR2和TLR4活化是否导致血小板活化。FACS检测P-selectin表达情况;ELISA检测PF-4的表达水平。6.用替罗非班（tirofiban）抑制血小板表面GPⅡb/Ⅲa后,验证白念珠菌是否仍能活化血小板。FACS验证GPⅡb/Ⅲa抑制效果;FACS检测P-selectin表达情况;WB检测AKT磷酸化的水平。7.中和抗体封闭血小板表面GPⅡb/Ⅲa,验证白念珠菌是否仍能活化血小板。采用FACS检测P-selectin表达情况。8.将血小板加入THP-1单核样细胞/人原代单核细胞与FUN-1荧光标记的白念珠菌共孵育体系中,显微镜下观察血小板组与对照组（不含血小板）中THP-1/原代单核细胞吞噬白念珠菌的情况;FACS检测THP-1/原代单核细胞FUN-1的平均荧光强度;real-time PCR检测THP-1/原代单核细胞促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6及CXCL8的表达情况。9.采用西洛他唑（Cilostazol）、替罗非班分别抑制血小板活化及GPⅡb/Ⅲa后,再将处理后的血小板加入THP-1细胞与白念珠菌共孵育体系中,验证调节单核细胞免疫反应是否依赖于GP Ⅱb/Ⅲa介导活化的血小板而非未激活的血小板。FACS检测THP-1细胞FUN-1的平均荧光强度;real-time PCR检测IL-1β的表达。三、实验结果1.白念珠菌上调血小板表面活化标记物P-selectin的表达,促进血小板分泌抗菌趋化因子PF-4和CCL5,炎症因子TNF-α,趋化因子CXCL8及抗菌肽β-defensin-2。2.白念珠菌上调血小板中信号分子AKT磷酸化的水平,而对Stat3、ERK1/2MAPK和p38 MAPK磷酸化无显著影响;抑制PI3K-AKT信号通路逆转了白念珠菌诱导的血小板活化。即白念珠菌诱导的血小板活化依赖于PI3K-AKT信号通路。3.白念珠菌导致血小板表面TLR2、TLR4水平增高,但对血小板总蛋白和mRNA水平上的TLR2、TLR4表达无显著影响;中和抗体封闭血小板表面TLR2、TLR4并不影响白念珠菌诱导的P-selectin的表达,且激活TLR2、TLR4对血小板P-selectin的表达和PF-4的分泌无显著影响,提示TLR2、TLR4并非介导白念珠菌活化血小板的受体。4.抑制或封闭血小板表面粘附受体GPⅡb/Ⅲa显著逆转了白念珠菌诱导的血小板活化。提示GP Ⅱb/Ⅲa介导白念珠菌激活血小板。5.血小板增强THP-1和原代单核细胞吞噬白念珠菌的能力;血小板上调了白念珠菌刺激下THP-1和原代单核细胞促炎因子的表达水平。6.在血小板、白念珠菌、THP-1单核样细胞共孵育体系中,抑制血小板活化后,血小板丧失了调节单核细胞抗白念珠菌免疫反应的能力;抑制血小板表面GPⅡb/Ⅲa导致血小板活化受抑制,因此血小板也丧失了调节单核细胞抗白念珠菌免疫反应的能力。提示GP Ⅱb/Ⅲa介导活化的血小板而非未激活的血小板调节单核细胞抗白念珠菌的免疫反应。四、结论1.白念珠菌诱导血小板活化及抗菌效应分子的分泌。2.白念珠菌通过PI3K-AKT信号通路激活血小板。3.白念珠菌诱导血小板活化依赖GP Ⅱb/Ⅲa受体,而不依赖于TLR2和TLR4。4.GP Ⅱb/Ⅲa介导活化的血小板促进人单核细胞抗白念珠菌的固有免疫反应。