肿瘤的发生是一个多基因参与、多阶段、多步骤的复杂过程，迄今大量的研究已证实，肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变。因此，肿瘤的基因治疗已成为现代广大肿瘤学者的研究热点。随着现代分子生物学及其相关学科的飞速发展，肿瘤基因治疗将成为除手术、放疗和化疗等方法外又一新的抗癌策略。然而，肿瘤基因治疗至今尚未成为临床治疗恶性肿瘤的常规治疗措施，其关键因素之一就是目前仍然缺乏将治疗基因导入肿瘤细胞的高效靶向性载体系统。丝状噬菌体基因治疗载体是近几年来出现的一种新型基因治疗载体，和其他病毒载体相比他具有靶向性好，易于制备，没有天然宿主噬性，稳定性好，可同时展示多个或多种靶向元件的优点，是一类很有希望的基因治疗载体。表皮生长因子受体(EGFR)作为一个广泛表达的看家基因(Housekeeping gene)，其改变(突变、高表达等)在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。多年来的研究表明EGFR在头颈部肿瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌等多种肿瘤中存在突变或高表达。因此，已经有很多研究把EGFR作为肿瘤的治疗靶点，除了直接拮抗EGFR(如Getifinib，Cetuximab)外，还可利用EGFR介导靶向基因治疗。本研究旨在建立一种EGFR靶向的噬菌体基因导入系统并检验其有效性，为肿瘤的靶向性基因治疗提供可靠的理论依据与实践指导。第一部分EGFP-EGF融合蛋白在探究表皮生长因子内吞机理中的应用【目的】初步探讨EGFP-EGF蛋白在细胞内的内吞途径，以作为后续实验研究的基础。【方法】使用基因克隆的方法构建编码EGFP-EGF序列的表达质粒；在原核表达系统中进行蛋白表达，使用Ni-NTA beads和Amicon Ultra-4离心超滤浓缩系统进行蛋白的纯化和浓缩；采用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达的蛋白进行鉴定。通过细胞特异性结合实验，共聚焦显微镜以及荧光激发的流式细胞分选实验验证表达纯化的EGFP-EGF蛋白是否具有一定的生物学活性、特异性和靶向性。【结果】成功表达并纯化了分子量为36KDa的EGFP-EGF绿色融合荧光蛋白。细胞特异性结合实验发现EGFP-EGF蛋白可以与高表达EGFR的细胞如HeLa、NCI-H1299结合，而且EGFP-EGF蛋白与EGFR结合可以被EGF所竞争抑制。细胞内吞实验显示低剂量EGF(即EGF终浓度为1.5 ng／ml)主要通过网格蛋白(Clathrin)介导的内吞途径进行内吞，可分别与Clathrin及早期内体(Early endosome)的标记物EEA1和溶酶体(Lysosome)的标记物LAMP1共定位。荧光激发的流式细胞分选实验结果显示，随着时间的延长，细胞内EGFP-EGF蛋白内吞逐渐增多，并在很短的时间内达到饱和，表明蛋白与受体结合后细胞的快速内吞。【结论】表达纯化的EGFP-EGF蛋白具有一定的生物学活性、特异性和靶向性；EGFP-EGF蛋白在EGFR的介导下能够通过正常的内吞途径进行内吞。第二部分展示EGF的噬菌粒颗粒的内吞【目的】初步探讨EGFR介导的靶向噬菌粒颗粒在细胞内的内吞途径及分布。【方法】将EGF编码序列插入到辅助噬菌体(M13K07)pⅢ基因5’端，然后以该辅助噬菌体质粒转化F~+的ER2738大肠杆菌，将此细胞称为LMP细胞，随后将含有报告基因或治疗基因的噬菌粒转化LMP感受态细胞，即可制备靶向性噬菌粒颗粒。采用ELISA方法进行噬菌粒颗粒的定量，通过单链DNA凝胶电泳分析子代颗粒中噬菌粒颗粒所占的比例；利用Western blot实验分析噬菌粒颗粒中配体蛋白展示的水平；然后用这些噬菌粒颗粒进行体外基因转染，检测转染效率。采用内吞实验和免疫荧光实验对展示EGF配体蛋白的噬菌粒颗粒在细胞内的内吞途径以及分布进行探讨。【结果】成功获得了编码EGF-pⅢ融合蛋白的辅助噬菌体质粒M13K07EGFCT；该辅助噬菌体可以有效地包装噬茵粒如pEGFP-Amp；所形成的噬菌粒颗粒在子代颗粒中占绝大多数。Western blot显示EGF高效地展示在噬菌粒颗粒上；这些噬菌粒颗粒可以被EGFR表达阳性的细胞如PC-3，NCI-H1299细胞所内吞；体外转染实验中，M13K07EGFCT产生的噬菌粒颗粒可以使约10％的PC-3细胞表达报告基因(EGFP)。免疫荧光共聚焦结果显示，在低浓度时(即展示的EGF终浓度约为0.5 ng／ml)，噬菌粒颗粒入胞主要通过Clathrin依赖的内吞途径，而在高浓度时(即展示的EGF终浓度约为7.5 ng／ml)，细胞的内吞由Clathrin和Caveolin 1两条途径来介导，并可分别与早期内体(Early endosome)的标记物EEA1及溶酶体(Lysosome)的标记物LAMP1共定位，说明展示EGF的噬菌粒颗粒可在EGFR介导下通过正常的内吞途径来进行内吞。【结论】我们成功发明了高水平展示配体蛋白的噬菌粒颗粒的新制备方法，这种方法可以在噬菌体表面高效展示配体蛋白或多肽。展示配体蛋白的噬菌体颗粒在EGFR的介导下能够通过正常的内吞途径进行内吞。多肽靶向性噬菌粒颗粒有望成为肿瘤基因治疗的新型载体。第三部分表皮生长因子受体(EGFR)介导的靶向性噬菌体基因治疗载体的改造【目的】对展示EGF配体蛋白的辅助噬菌体M13K07EGFCT进行了改造，以进一步提高转导的目的基因在细胞内的表达效率。【方法】将核定位信号(NLS)和RGD-4C多肽分别展示在辅助噬菌体(M13K07EGFCT)pⅥ蛋白羧基端和pⅦ蛋白氨基端，然后以该辅助噬菌体和含有报告基因的噬菌粒共转染F~+的ER2738感受态细胞，获得展示多个靶向性元件或多肽的噬菌粒颗粒。采用ELISA方法进行噬菌粒颗粒的定量，通过单链DNA凝胶电泳分析子代颗粒中噬菌粒颗粒所占的比例；利用Western blot实验分析噬菌粒颗粒中配体蛋白展示的水平；然后用这些噬菌粒颗粒进行内吞实验和体外基因转染实验，检测其入核效率和转染基因表达效率。【结果】成功获得了改造的辅助噬菌体的质粒载体M13K07EGFCT-pⅥ-NLS(用于在pⅢCT展示EGF及在pⅥ展示核定位信号NLS)、M13K07EGFCT-pⅥ-RGD(用于在pⅢCT展示EGF及在pⅥ展示RGD-4C)、以及M13K07EGFCT-pⅦ-NLS(用于在pⅢCT展示EGF及在pⅦ展示NLS)、M13K07EGFCT-pⅦ-RGD(用于在pⅢCT展示EGF及在pⅦ展示RGD-4C)、M13K07RGDCT(用于在pⅢCT展示RGD-4C)。其中只有M13K07EGFCT-pⅦ-NLS，M13K07RGDCT，M13K07EGFCT-pⅦ-RGD能够有效包装噬菌粒颗粒和高效展示配体蛋白或多肽，这些噬菌粒颗粒可以被EGFR表达阳性的细胞如HeLa、7721细胞所内吞；然而，在免疫荧光内吞实验中，用M13K07EGFCT-pⅦ-NLS包装的噬菌粒颗粒内吞后入核效率并没有明显增加，在体外转染实验中，用M13K07EGFCT-pⅦ-NLS，M13K07RGDCT以及双靶向的噬菌体M13K07EGFCT-pⅦ-RGD其导入报告基因的表达效率亦没有显著提高，产生的噬菌粒颗粒只使约8％的HeLa细胞、4％的7721细胞以及3％的SKOV-3细胞表达报告基因(EGFP)。【结论】应用展示核定位信号(NLS)和RGD-4C肽的辅助噬菌体(M13K07EGFCT)包装的噬菌粒颗粒体外导入细胞，内吞发现并没有显著提高报告基因在细胞内的入核和表达效率，具体原因尚有待进一步研究。第四部分EGFR介导的靶向性噬菌体载体进行siRNA导入的研究【目的】初步探讨EGFR介导的靶向性噬菌体载体用于siRNA导入的可能性。【方法】应用基因克隆的方法构建依赖于DNA载体的shRNA表达系统pSilencer1.0-siEGFP和pSilencer4.1-siAkt。然后将其与辅助噬菌体M13K07EGFCT共转染F~+的ER2738感受态细胞，获得包装有siRNA基因的噬菌粒颗粒。采用ELISA方法进行噬菌粒颗粒的定量，通过单链DNA凝胶电泳分析子代颗粒中噬菌粒颗粒所占的比例；然后用这些噬菌粒颗粒进性体外基因转染实验以及随后的Western blot检测，以观察其对内外源性基因表达的干扰效果。用羟基喜树碱处理，检测转染效率是否能够提高。【结果】成功获得了包装有pSilencer1.0-siEGFP和pSilencer4.1-siAkt单链DNA基因组的噬菌粒颗粒；将含有pSi1.0-siEGFP的噬菌粒颗粒体外转导细胞，在添加羟基喜树碱时，能够有效抑制转染有pEGFP-N1质粒的NCI-H1299细胞表达EGFP；使用包装有pSi4.1-siAkt的噬菌粒颗粒以不同浓度转染细胞后，经羟基喜树碱(Hydroxycamptothecin)处理，Western-Blot检测，结果显示Akt的蛋白表达水平与无关对照和空白对照相比明显受到抑制，并且随着载体量的增加其干扰效果随之加强，最高抑制Akt蛋白表达量约50～60％，与使用脂质体介导的细胞转染效果相当。【结论】EGFR介导的靶向性噬菌粒颗粒作为基因导入载体介导siRNA导入细胞，在羟基喜树碱作用下，能够一定程度上特异抑制内外源性靶基因的表达，这对于今后探讨噬菌体基因导入载体在肿瘤靶向基因治疗中的应用具有一定的理论和实践指导意义。