【研究背景】因先天因素、损伤、炎症或肿瘤等原因造成尿道缺损的治疗一直是泌尿外科的难题,目前文献报道临床治疗方法多种多样,但其修复多用自身其他组织替代,如用自体皮肤粘膜、膀胱粘膜、口腔粘膜或阑尾等,或者游离松解尿道断端后行端端缝合;但这些方法以牺牲正常组织为代价,手术创伤大,加重患者的创伤,且术后并发症多,效果不甚理想。组织工程方法是尿道缺损修复的一个方向,并取得了突破性进展,最初的研究采用在人工合成细胞支架上种植尿道粘膜及平滑肌细胞修复尿道缺损,近年来多用小肠粘膜下层(SIS)、膀胱粘膜下层(BAMG)或脱细胞基质支架(ECM)。目前尿道组织工程研究常用的细胞支架有人工合成细胞支架、天然材料细胞支架及脱细胞基质支架。尿道组织工程虽然取得了很大进步,但尚未找到理想的细胞支架,仍有大量问题需要解决,存在问题:①人工合成细胞支架的组织相容性较差,引起不同程度的炎症反应,且价格昂贵;②天然材料细胞支架及脱细胞基质支架来源缺乏,加工能力有限,耗资高,难以形成产业化。因此研究生物性能好、价格低廉、原料来源丰富的细胞支架是组织工程学的一个重要课题。科研人员一直致力于研究、探索开发新型的细胞支架,主要在原材料、制作工艺、支架材料改性及表面修饰等方面寻找突破点。蚕丝作为一种天然的高分子材料近年来受到人们的广泛重视,其提取物丝素蛋白是蚕丝的重要组成成分,其无毒性、无刺激作用,对机体细胞粘附能力强,具有良好的物理化学性能和生物相容性,以丝素蛋白为原料制成的组织工程细胞支架、手术缝线、隐形眼镜、人工血管、皮肤创面保护膜、硬脑膜修补材料效果良好,在生物医学领域得到广泛的应用。同时丝素蛋白来源丰富,价格低廉,具有巨大的潜力和优势,但其作为细胞支架用于修复尿道缺损尚未有报道。【目的】本研究旨在探索丝素蛋白膜作为组织工程细胞支架修复尿道缺损的可行性及效果。【材料与方法】1.动物和材料:雄性新西兰兔(2.5—4.5Kg)24只(南方医科大学动物实验中心);丝素蛋白膜:孔径150～250μm,孔隙率85%～95%(本材料由浙江大学闵思佳教授惠赠);广谱细胞角蛋白单克隆抗体(PCK)(博士德公司)。2.动物分组:24只兔随机分成3组:实验组(n=12),对照组Ⅰ(n=6),对照组Ⅱ(n=6)。3.实验方法:3.1实验组:游离出尿道海绵体,将尿道海绵体切除1.5cm,用1.5cm长丝素蛋白支架修复尿道缺损;3.2对照组Ⅰ:行尿道海绵体游离后即逐层缝合海绵体包膜、皮下组织及皮肤;3.3对照组Ⅱ:游离出尿道海绵体,将尿道海绵体切除1.5cm后逐层缝合切口。4.检测方法:组织再生情况观察及逆行尿道造影4.1实验组在术后2、4周、8周、16周每次3只行逆行尿道造影,然后处死取材行苏木精—伊红(HE)染色、Van Gieson(VG)染色及免疫组织化学染色观察组织再生情况;4.2对照组Ⅰ及对照组Ⅱ分别在术后8周及16周每次各取3只行逆行尿道造影,然后处死取材行苏木精—伊红(HE)染色、Van Gieson(VG)染色及免疫组织化学染色观察组织再生情况;【结果】1.实验中兔存活及手术切口愈合情况:24只兔实验过程中无一例死亡。对照组Ⅱ1只兔于术后2周发生尿瘘。2.组织标本肉眼观察:对照组Ⅰ手术区尿道无缺损及瘢痕形成,无尿道狭窄;对照组Ⅱ术后8周瘢痕形成,可见部分缺损,16周时手术区较对照组Ⅰ狭窄,组织质地坚韧;实验组丝素蛋白膜均固定于原位,术后2周丝素蛋白膜无明显变化,表面部分被组织覆盖;4周时丝素蛋白膜已部分降解,表面覆盖的组织增多;8周时,丝素蛋白膜进一步降解成碎片状,组织均匀覆盖;16周修复区丝素蛋白膜已难于分辨,修复区与对照组Ⅰ无明显差别。3.逆行尿道造影示:对照组Ⅰ6只兔无尿道狭窄、尿瘘及梗阻;对照组Ⅱ除1只兔出现尿瘘未行造影检查外,其余5只兔均有不同程度狭窄,手术区显僵硬感;实验组12只兔未见明显狭窄,无尿瘘及梗阻,术后2周时修复区粗糙、不光滑,术后8周后尿道造影与对照组Ⅰ无明显差异。4.组织学检查:苏木精—伊红(HE)及Van Gieson(VG)染色4.1对照组Ⅰ术后8周及16周尿道组织结构无明显区别,尿道上皮细胞均匀覆盖,层数约4—5层,排列规则,未见炎症细胞,粘膜下可见较多的平滑肌细胞,无纤维化形成。4.2对照组Ⅱ8周时腔壁纤维化形成,可见大量的纤维组织及成纤维细胞,大部分区域上皮细胞缺失;16周仍以纤维组织为主,瘢痕化形成,可见陈旧性纤维组织,上皮细胞增多,排列混乱,偶可见少量平滑肌细胞。4.3实验组术后2周修复区未见明显上皮细胞覆盖,偶可见少数上皮细胞,丝素蛋白支架网眼中有大量炎症细胞浸润,包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性细胞;4周时仍可见较多炎症细胞,丝素蛋白支架表面粘附细胞排列不均匀,层数约6—8层;8周时尿道上皮细胞排列较4周时均匀,渐趋向规则,层数约5—7层,偶可见零星平滑肌细胞及口径较小的血管组织,炎症细胞明显减少,可见较多的成纤维细胞及胶原纤维;16周尿道上皮细胞排列均匀,完全覆盖,层数约4—5层,平滑肌细胞增多,成纤维细胞及胶原纤维较8周时减少,排列规则,无明显炎症细胞浸润,可见血管口径增大,与对照组Ⅰ相似。5.免疫组织化学检查:应用广谱细胞角蛋白单克隆抗体染色,对照组Ⅰ尿道上皮细胞呈阳性棕黄色,高倍镜观察可见胞浆内棕黄色网状角蛋白颗粒,排列规则;对照组Ⅱ术后8周大部分区域上皮细胞缺失,少数区域可见少量上皮细胞,术后16周时上皮细胞增多,但排列混乱、层数不一;实验组尿道粘膜细胞胞浆呈棕黄色,,术后4周至16周上皮细胞排列渐趋规则。【结论】丝素蛋白膜能够诱导尿道粘膜上皮细胞及尿道平滑肌的生长,具有促进尿道缺损修复的能力。