β-葡萄糖苷酶是香花中醇系香气形成的关键酶类。本文在优化β-葡萄糖苷酶提取以及活性分析条件的基础上,比较蜡梅不同品种和鲜花开放不同时期β-葡萄糖苷酶活性的变化,并首次对蜡梅花β-葡萄糖苷酶进行分离纯化和有关酶学性质的研究,为今后深入研究蜡梅花香形成机理提供理论依据。本项研究主要研究结果如下: 1.蜡梅花β-葡萄糖苷酶提取和活性分析条件的优化。 以pNPG为底物,对蜡梅花中β-葡萄糖苷酶提取和活性分析条件进行了研究。结果表明,PVP加入量对酶活性影响较大。随着PVP加入量的增大,酶活性呈现上升的趋势,当PVP加入量与花等量时,酶活性达到最大值。缓冲液类型和pH值对酶活性也有较大影响。随着pH值的增大,酶活性均呈现先增后减的趋势,当pH为5.0时酶活性达到最大值。在相同pH条件下,柠檬酸-柠檬酸三钠提取的酶活性最大。酶的吸收波长分析结果表明,在波长为410nm下测定β-葡萄糖苷酶,能获得最大的光吸收值。酶促反应以37℃为宜,在此条件下反应120分钟内酶活性分析结果具有稳定性。据此,β-葡萄糖苷酶提取条件为:加入与花等量的PVP,以pH为5.0的柠檬酸-柠檬酸三钠作为提取缓冲液;而β-葡萄糖苷酶活性分析的条件为:酶促反应温度为37℃,反应时间为120分钟内,测定波长为410nm。 2.蜡梅不同品种和鲜花开放不同时期β-葡萄糖苷酶活性变化 素心蜡梅Ⅰ、素心蜡梅Ⅱ、罄口蜡梅和狗蝇蜡梅花中β-葡萄糖苷酶活性变化的研究表明,从黄蕾到全开过程,素心蜡梅Ⅱ花中β-葡萄糖苷酶活性均高于其它蜡梅品种,素心蜡梅Ⅰ和罄口蜡梅居中,而狗蝇蜡梅最低。在鲜花开放的不同时期,不同蜡梅品种鲜花β-葡萄糖苷酶活性的变化趋势大体上一致,均表现为黄蕾>初开>全开>青蕾>萎蔫,从黄蕾到全开过程β-葡萄糖苷酶活性略有下降,但保持在较高水平,而从全开到萎蔫的过程酶活性下降迅速。提示蜡梅花香气的变化与内源β-葡萄糖苷酶的活性有关。 3.β-葡萄糖苷酶的分离纯化 采用硫酸铵分级沉淀法和CM-52 Cellulose离子交换层析法对素心蜡梅Ⅱ花中β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,得到Glucosidase-Ⅰ、Glucosidase-Ⅱ和Glucosidase-Ⅲ3个酶级分。利用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对主要级分Glucosidase-Ⅲ进一步纯化,能得到纯度较高的β-葡萄糖苷酶主要级分Glucosidase-Ⅲ,该酶的纯化倍数提高了12.6倍,得率为2.4%,比酶活为0.244U/mg。 4.β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 Glucosidase-Ⅲ酶学性质研究表明,该酶最适pH为4.0,在pH4.0—6.0之间比较