亚洲饮食习惯和祖国传统医学中,药用真菌(蘑菇)一直被用作预防和防治疾病的食品、保健品甚至药物,如应用于高血压、糖尿病、明显的炎症、癌症等疾病的食补和治疗。黄伞是药食性真菌,随着深入研究,已发现黄伞次级代谢物可用于提高小鼠免疫系统功能,以及可能应用于肿瘤的治疗。本文针对黄伞菌药食性真菌的化学成分及抗肿瘤研究进展,深入分析了新的黄伞菌抗肿瘤活性物质对肿瘤细胞增殖抑制、诱导凋亡和信号途径等方面的影响,提供了文献研究基础。本文旨在研究黄伞粗提物对非小细胞肺癌(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、小鼠巨嗜瘤(RAW264.7)和Wistar大鼠心肌成纤维细胞(CF)的细胞毒性和凋亡进行测定,并通过高效液相色谱法(HPLC)进一步分离纯化影响以上几株细胞黄伞次级代谢物的成分,为获取单一组分奠定了基础。通过双提法首先利用乙酸乙酯对新鲜的黄伞子实体粗提取、旋蒸,甲醇的再提取、旋蒸的方法,获得黄伞次级代谢物浸膏,并在Hela、CF、A549和RAW264.7在培养液中加入不同浓度的黄伞次级代谢物,分别孵育12h、24h和48h,利用MTT法检测几株不同细胞的细胞毒性,以及线粒体膜电位(JC-1)和Hoechst33258染色检测几株不同细胞的凋亡情况。用优化后的HPLC分离过程中分别调节流动相甲醇和水的比例,每2min收集一次流出液,通过旋蒸、称重获得分离物,采用MTT方法分别检测11种不同组分分别检测对A549细胞增殖的影响。我们观察了不同浓度黄伞次级代谢物处理对几株细胞形态的影响,结果显示细胞体积和细胞核明显减小,逐渐趋向圆形,细胞的活性和粘附性明显下降,视野中出现越来越多的细胞碎片和漂浮细胞。紧接着我们检测了不同浓度黄伞次级代谢物处理对几株细胞凋亡的影响,Hoechst33258染色结果显示,正常细胞细胞核呈蓝色,其它几株细胞中,对照组细胞核呈蓝色,凋亡的细胞中出现较明显的细胞核致密浓染,且核中出现颜色发白碎块装致密浓染。线粒体膜电位的检测结果显示,在Wistar大鼠心肌成纤维细胞(CF)中,对照组和实验组红色和绿色荧光分布均匀;而在其它几株细胞中发现,细胞在经过黄伞次级代谢物孵育后,细胞中的红色荧光逐渐减少,绿色荧光逐渐增多,从而判断细胞中线粒体膜电位逐渐下降。因HEK293是一种半贴壁细胞,黄伞次级代谢物处理后,易引起细胞脱落,后期染色获得细胞数量太少,该株细胞不作检测。综上结果表明,黄伞次级代谢物具有诱导细胞凋亡的功效。其结果显示黄伞次级代谢物对A549和Hela细胞均有抑制作用,呈现时间和剂量的依赖性,对RAW264.7和CF细胞抑制效果较小,且短时间处理具有促进作用。线粒体膜电位(JC-1)和Hoechst33258染色检测表明,黄伞次级代谢物可以诱导A549和Hela细胞发生不同程度的凋亡,而对正常的Wistar大鼠CF细胞在一定浓度和时间范围内影响不显著。HPLC分离纯化中,流动相甲醇的浓度设定的范围在20%-40%,以40%的甲醇作为流动相,按时间段收集各组分;而以20%的甲醇作为流动相,以峰收集各组分;以20%和40%甲醇为流动相分离纯化的样品,最终MTT法进行验证实验结果。40%甲醇作为流动相所得实验结果,在2-4min和4-6min黄伞提取物对A549促凋亡效果明显;用20%甲醇作为流动相所得实验结果,在5-6.5min和6.5-10min黄伞提取物对A549促凋亡效果明显。根据实验数据显示,黄伞次级代谢物对细胞在抑制增殖和诱导凋亡发挥重要作用,还需进一步分离纯化黄伞菌具有抗肿瘤的活性成分。本文主要内容分为六章:第一章绪论,主要综述了黄伞次级代谢物研究的进展,及其不同组分对肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学的影响,第二章,心肌成纤维细胞的分离及纯化,以及癌细胞的冻存、复苏和培养。第三章,黄伞次级代谢物的粗分离。第四章,黄伞次级代谢物对细胞增殖、抑制的研究,主要介绍MTT细胞活性和半抑制浓度的检测。第五章,黄伞次级代谢物对细胞凋亡及凋亡途径的初步研究,主要针对RAW264.7、A549、Hela和CF几株细胞,利用线粒体膜电位和Hoechst33258染色方法对其凋亡的检测。第六章,通过用HPLC对黄伞次级代谢物分离纯化,收集不同区段,分别检测对A549细胞增殖和凋亡的影响,尽可能分离出单个组分。第七章,总结与展望,总结实验所得主要结论,对后续工作进行展望。