Akt1对PMS2蛋白的靶向调节作用及卵巢癌铂类耐药的机制研究

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第一部分Akt1,P-AktS473和PMS2在不同肿瘤细胞株中的表达及相关性  目的  检测Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在人类不同肿瘤细胞株:A2780,Caov3,C13K,ES2,HO8910,OV2008,A875,A549,ACHN,Lovo,SW480和MCF-7中的表达及相关性。  方法  1.WesternBlot检测Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在A2780,Caov3,C13K,ES2,HO8910,OV2008,A875,A549,ACHN,Lovo,SW480和MCF-7中的表达水平。  2.Akt1激动剂IGF-1活化其活性后,WesternBlot检测Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在A875,ES2和Caov3细胞中表达水平改变情况。  3.Akt1特异性抑制剂API-2和AktInhibitorI,抑制Akt1活性后,WesternBlot检测Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在OV2008和A2780细胞中表达水平改变情况。  4.应用siRNA干扰Akt1基因的表达水平后,实时定量PCR检测Akt1及PMS2mRNA在A2780细胞中的变化情况;WesternBlot检测Akt1,P-AktS473和PMS2蛋白在A2780细胞中表达水平改变情况。  结果  1.Akt1,P-AktS473和PMS2三种蛋白在13株细胞内均有表达,但表达平高低不一:在C13K,Caov3,ES2,HO8910,Lovo,ACHN和A875细胞株中PMS2蛋白高水平表达,同时Akt1的活化形式P-AktS473蛋白处于低表达水平,其中ES2细胞株中P-AktS473蛋白表达缺失;在A2780,OV2008,SW480和A549细胞中,PMS2蛋白表达水平低,但伴随着高水平的P-AktS473蛋白表达;在Hela和MCF-7细胞株中P-AktS473和PMS2蛋白均有高水平表达。即Akt1的活化形式P-AktS473与PMS2蛋白表达呈负相关。  2.应用Akt1激动剂IGF-1上调Akt1的活性后,肿瘤细胞株A875,ES2和Caov3中PMS2表达水平明显下降,且与IGF-1的作用存在时间依赖性。  3.应用Akt1的特异性抑制剂API-2和AktInhibitor-1抑制Akt1的活性后,肿瘤细胞株A2780和OV2008中PMS2表达水平明显升高,且与API-2和AktInhibitor-1的作用存在时间依赖性。  4.应用siRNA抑制Akt1基因mRNA表达水平后,A2780细胞中活化Akt1蛋白表达明显下降,但PMS2mRNA表达水平无明显变化的情况下伴随PMS2蛋白表达水平明显增高。  结论  不同的肿瘤细胞株中,PMS2蛋白表达与Akt1的活化形式P-AktS473蛋白的表达呈负相关,PMS2蛋白的表达可能受活化Akt1的调控。  第二部分Akt1对PMS2的靶向调节作用的机制研究  目的  探讨Akt1是否靶向调节PMS2蛋白的表达及其稳定性。  方法  1.直接免疫共沉方法检测Akt1和PMS2蛋白自然状态下是否直接结合。  2.建立Akt1-wt+PMS2-wt及Akt1-wt+PMS2-T156A共转染的稳定表达细胞株,检测外源性的Akt1与PMS2和突变体PMS2蛋白的结合情况。  3.API-2特异性抑制Akt1活性后,CHX抑制蛋白合成,检测PMS2蛋白半衰期变化情况。  4.CHX抑制蛋白合成,检测PMS2-wt和PMS2-T156A稳定转染细胞株中,外源性PMS2蛋白半衰期变化情况。  5.应用API-2和siRNA抑制Akt1活性后,细胞免疫荧光观察PMS2蛋白细胞内的分布情况的变化。  结果  1.在Hela,A875和A2780细胞株中,anti-PMS2抗体可以将Akt1蛋白沉淀下来,同时anti-Akt1抗体沉淀下来的免疫复合物中可以检测到PMS2蛋白存在。  2.Akt1-wt+PMS2-wt质粒共转染的SW480细胞中,anti-PMS2抗体可沉淀下Akt1蛋白;anti-Akt1抗体可沉淀下PMS2蛋白。共转染Akt1-wt+PMS2-T156A质粒的SW480细胞中,anti-PMS2抗体沉淀下Akt1蛋白及anti-Akt1抗体沉淀下PMS2蛋白的量明显下降。  3.在Hela,A875和A2780细胞株中,API-2特异性抑制Akt1活性后,PMS2蛋白的半衰期明显延长。  4.在Hela,A875和A2780细胞株中,与PMS2-wt稳定转染细胞相比,PMS2-T156A稳定转染细胞中PMS2蛋白的半衰期明显延长。  5.在Hela及A875细胞中,API-2或siRNA抑制Akt1的活性后,PMS2蛋白从细胞浆转移至细胞核内,即出现核移位,主要表达于细胞核内。  结论  Akt1可以直接与PMS2蛋白结合并降低其稳定性,且影响PMS2蛋白的亚细胞定位。  第三部分PMS2介导的铂类所致DNA损伤后的促凋亡作用与卵巢癌耐药的机制研究  目的  探讨PMS2蛋白是否影响铂类所致DNA损伤后的凋亡途径,从而参与卵巢癌铂类耐药的发生。  方法  1.顺铂处理细胞后,WesternBlot检测不同PMS2蛋白表达水平的A2780和ES2细胞中P53,P63,P73,Caspase-3和Caspase-9凋亡相关蛋白的变化。  2.顺铂处理细胞后,细胞免疫荧光检测不同PMS2蛋白表达水平的细胞中细胞核的固缩、核碎裂情况。  3.流式细胞仪检测,相同顺铂处理后,不同PMS2蛋白表达水平的细胞凋亡率的变化情况。  4.流式细胞仪检测,相同顺铂处理后,不同PMS2蛋白表达水平的细胞中细胞周期的变化情况。  结果  1.在卵巢癌细胞株A2780和ES2中,PMS2可诱导顺铂所致DNA损伤后P63的表达明显增高,且P63蛋白的表达增加与顺铂用量存在剂量依赖性。  2.细胞免疫荧光检测显示,PMS2表达水平高的细胞株中,顺铂所致的细胞核固缩、核碎裂明显增加。  3.PMS2可使顺铂致DNA损伤后的卵巢癌细胞株的凋亡率明显增高,促进细胞的凋亡作用。  4.PMS2可促进顺铂致DNA损伤后的卵巢癌细胞株的G2/M期停滞,促进细胞的凋亡作用。  结论  PMS2介导的顺铂所致的DNA损伤后的促凋亡作用和细胞周期G2/M期停滞,可能影响卵巢癌细胞对铂类药物作用的敏感性,从而参与耐药的发生。
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