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[目的]以钛和钛合金为代表的骨植入材料以其良好的生物相容性在口腔、颅颌面以及骨关节等领域得到广泛应用,但是在外伤、感染以及患者伴有系统性疾病(骨质疏松、糖尿病以及肿瘤)等情况下,种植体的成功率大打折扣,甚至无法应用。为了满足患有骨疾患或者骨生理缺陷等病人的需求,越来越多的研究者希望能够通过表面改性技术获得针对特定人群的、具有不同作用的功能种植体。本课题组通过电化学沉积(Electrophoretic deposition,EPD)方法在钛种植体表面制备壳聚糖/明胶(Chitosan/gelatin, CS/G)涂层,以期这种涂层能够有效促进种植体周围的新骨形成,并且不会影响最终种植体与骨之间直接的骨结合,这样CS/G涂层就可以作为功能种植体表面的基底,载入具有不同生物学作用的活性分子或者金属离子。在预防和治疗骨质疏松症方面,锶代表了一个重要的研究方向。在第一部分研究的基础上,本课题组进一步探索了在CS/G涂层中载入金属锶离子(strontiu,Sr),从而制备出Sr/CS/G涂层,并对这种涂层的物理化学性质及细胞生长情况进行检测分析,以期骨质疏松病人在植入Sr/CS/G种植体时其成功率可以有所提高。第—部分壳聚糖/明胶涂层的物理化学性质及其在体内的组织反应研究实验一壳聚糖/明胶涂层的制备[材料与方法]购买纯钛棒并加工为直径1.5cm,厚度为1mm的钛片。将钛片经过喷砂、酸蚀处理得到Sand-blasted acid(SA)钛片备用。配置壳聚糖浓度为0.6%,明胶浓度为1.4%的壳聚糖/明胶(CS/G)溶液。将SA钛片作为阴极,铂金片作为阳极,壳聚糖/明胶溶液为电化学沉积液,在一定的电场作用下,在SA钛片表面制备CS/G涂层。[结果]在电压3.5V,持续通电3分钟后,SA钛片表面可以看到均匀沉积一层带有气泡的凝胶状物质,有黏性,干燥后与钛片有较好的结合强度,在室温下干燥后呈薄膜状。实验二壳聚糖/明胶涂层物理化学性质研究[材料与方法]CS/G涂层制备之后,用数显千分尺对涂层的厚度进行测量,利用壳聚糖本身可以自发荧光的特点对在PBS中浸泡不同时间的涂层进行观察。同时,干燥的CS/G涂层浸入PBS中不同时间其吸水程度是不同的,根据吸水量的变化来观察涂层的溶胀情况。溶菌酶是能够降解壳聚糖的酶之一,本实验将干燥的CS/G钛片置于溶菌酶-PBS溶液中,在不同的时间点观察CS/G涂层质量降低的情况,从而获得该涂层的降解信息。[结果]经测量,新制备的CS/G涂层厚度约为392μm,干燥之后的厚度约为35μm。从荧光显微镜下观察涂层,可以看到CS/G涂层发出蓝色的荧光及其多孔结构。在PBS中浸泡的最初阶段,CS/G涂层的孔径比较大,孔壁较厚实；随着在PBS中浸泡时间的延长,涂层的孔径在逐渐变小,孔壁逐渐变薄。经过统计分析,CS/G涂层的孔径范围在50-350μm之间,主要以50-200μm之间为主。干燥后的CS/G涂层在PBS中10分钟内便可以达到最大的吸水程度,之后逐渐降低,1-2小时内维持在一个平衡状态。CS/G涂层在溶菌酶-PBS中最初的14小时内降解速度最快,14小时后降解速度逐渐变慢,并最终趋于稳定。ATR-FTIR光谱分析结果显示新制备的干燥CS/G涂层和在溶菌酶-PBS中降解28天后的涂层均存在壳聚糖和明胶的特征吸收峰,而且壳聚糖和明胶特征峰的相对强度变化不大。实验三MC3T3-E1细胞在壳聚糖/明胶涂层的生长情况研究[材料与方法]将MC3T3-E1细胞接种在CS/G涂层表面,生长2天后,对细胞进行固定并染色(Rh和DAPI),观察细胞在涂层表面的生长形态。MC3T3-E1细胞在涂层表面生长1,3,7天后检测细胞的增殖情况,生长3,7,14天后用pNPP法检测细胞的ALP (alkaline phosphatase)活性。[结果]从荧光照片中可以观察到,CS/G涂层可以自发出绿色和蓝色的荧光,MC3T3-E1细胞胞内的肌动蛋白发出红色荧光,胞核发出蓝色荧光。除此之外还可以观察到MC3T3-E1细胞发出细长的丝状伪足。细胞的增殖和ALP活性结果显示,在各个检测时间点CS/G钛片与SA钛片两组之间没有显著性差异。实验四壳聚糖/明胶涂层改性后的种植体在体内的组织反应情况研究[材料与方法]首先设计并制备出带有深0.3mm凹槽的种植体,种植体分为上端和凹槽两部分进行分析,实验分为实验组CS/G种植体和对照组SA种植体。将两组种植体共计32枚植入16只新西兰白兔的股骨远端。在不同的时间点对观察12周的动物进行肌肉注射荧光染料。分别在2,4,8,12周处死动物,分别进行CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy). Micro-CT和硬组织切片观察。硬组织切片用亚甲基蓝和酸性品红染色。对BIC (direct bone-implant contact)和BV/TC(种植体周围0.3mm范围内的bone volume to total volume)两个参数进行分析。[结果]在CLSM下可以观察到CS/G种植体周围新骨形成的动态发生情况,最早注射的土霉素发出蓝光,茜素红发出红光,钙黄绿素发出绿光。在硬组织切片中可以观察到CS/G涂层在体内同样可以恢复其三维多孔支架结构,种植体周围矿化的发生可以沿着CS/G涂层。另外,在12周的切片中没有观察到CS/G涂层,这提示该涂层在12周时已经完全被降解吸收。Micro-CT和硬组织切片结果均显示,在各个时间点种植体上端的骨接触率和骨量在两组之间没有明显差异,而在8周和12周时,CS/G种植体凹槽区域的骨量明显多于SA种植体。第二部分载锶壳聚糖/明胶涂层物理化学性质研究实验五载锶壳聚糖/明胶涂层物理化学性质研究[材料与方法]取40mL配好的壳聚糖/明胶溶液,加入1gSrCl2,边加边搅拌,从而配置得到锶/壳聚糖/明胶电化学沉积液。其它步骤同实验一。将SA钛片作为阴极,铂金片作为阳极,锶/壳聚糖/明胶溶液为电化学沉积液,在一定的电场作用下,在SA钛片表面制备Sr/CS/G涂层。用ICP-AES检测该涂层在PBS溶液中缓释出的Sr2+浓度。用SEM观察涂层表面的形貌特征,EDS确定涂层表面所包含的元素,用XRD分析涂层中是否有含锶晶体物质的形成。TEM下观察Sr/CS/G溶液和CS/G溶液中物质的结构。另外将MC3T3-E1细胞接种在钛片,SEM下观察细胞在Sr/CS/G涂层表面的生长情况。[结果]Sr/CS/G涂层在PBS中的缓释结果表明,在1个月的观察时间内Sr2+在持续不断的缓慢释放。SEM下可以观察到Sr/CS/G涂层表面有较多的颗粒样物质,其直径约1-4μm；将这些颗粒放大,可以看到这些颗粒是由大量的更小的纳米微球所组成,这些微球表面附有一层有机物。通过EDS对该涂层进行元素分析,结果发现,Sr/CS/G涂层主要包括C、O、Cl、Sr四种元素,在非颗粒区域Cl的原子个数比为7.25%,Sr为3.5%；在颗粒区域：C1的原子个数比为2.52%,Sr为8.77%。据XRD物相定性分析,可初步判断XRD图谱中存在SrCl2.6H2O (JCPDF：06-0073)的衍射峰和SrCO3(JCPDF：05-0418)的衍射峰,除此之外还可以看到基底Ti的衍射峰。当Sr/CS/G涂层在PBS溶液中分别浸泡1、3、7天后,其XRD图谱中出现了三个新的衍射峰,峰位在30-32。之间。据XRD物相定性分析,可初步判断该峰为锶的磷酸盐的特征峰(JCPDF:24-0729)。TEM结果显示,Sr/CS/G电化学沉积液中形成了纳米微球结构,直径在200-400nm之间；为核-壳样结构,内部的核衬度较高,并且可以看到晶体样物质；外面的壳衬度比核的衬度要低,壳的外面有一层“绒面样”结构。在CS/G电化学沉积液中同样形成了纳米微球样结构,直径在100-300nm之间,其形态更规则,衬度较低。SEM下MC3T3-E1细胞在Sr/CS/G涂层表面可以完全伸展生长。[结论]1.通过EPD方法可以成功地在钛片表面制备出CS/G涂层；2.通过对CS/G涂层进行一系列的物理化学性质观察,可以发现利用EPD方法在钛片表面制备的CS/G涂层具有优良的降解性能、良好的吸水性能以及能够形成三维多孔支架结构等特性；3.通过观察MC3T3-E1细胞在CS/G钛片上的生长情况,本课题组发现CS/G涂层可以维持MC3T3-E1细胞的粘附和迁移；4.CS/G涂层无论是在体内还是体外遇水之后都可以形成其三维多孔的水凝胶样结构。该涂层在动物体内不仅可以完全被降解吸收,而且可以促进新骨的形成；5.通过EPD方法可以将氯化锶与壳聚糖／明胶共同沉积在钛片表面从而制备出Sr/CS/G涂层。