研究背景糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）是一种由糖尿病引起的独立于糖尿病大血管并发症的心肌结构和功能改变的疾病,与糖尿病特有的代谢异常密切相关。DCM是发达国家心衰发病率和死亡率居高不下的主要原因,随着肥胖和2型糖尿病发病率的逐年攀升,DCM发病率也随之升高。DCM病程漫长复杂,从亚临床阶段细微的心肌结构和功能异常,逐步发展到射血分数保留的舒张性心力衰竭,继而同时出现收缩功能障碍,最终导致严重的充血性心力衰竭。鉴于其临床危害严重,此领域的基础和临床研究接踵而至。迄今为止,在临床实践中仍无用以诊断DCM或构建治疗体系的针对性指南,因而该病的防治方法仍然有限,促使我们不断挖掘其发生和发展机制,并探讨潜在的防治策略。DCM的发病机理极其复杂。国内外学者逐渐认识到高糖和高胰岛素刺激以及胰岛素抵抗是DCM发病的源头和始动因素。目前观点认为代谢紊乱引发的心肌纤维化等结构重构是DCM发生和发展的重要病理表现。高糖和高胰岛素或胰岛素抵抗状态下,DCM心脏的特点是心肌胰岛素信号通路受损、线粒体和内质网功能障碍等。这些病理生理变化导致心肌间质纤维化、心肌肥厚和心脏舒张功能障碍,最终导致充血性心力衰竭。因此围绕代谢异常,以心肌纤维化为切入点,积极寻找此方面的干预靶点,从源头阻断2型糖尿病特有的代谢异常,才有望实现对DCM的遏制。单磷酸腺苷依赖激酶（AMP-actived protein kinase,AMPK）是调控2型糖尿病能量代谢和心肌纤维化的关键信号分子。AMPK在细胞能量代谢调节中发挥多种功能,可促进血糖吸收、降低血糖和血脂水平,增加胰岛素敏感性,与能量平衡调节密切相关。近来研究发现,AMPK信号通路在心肌纤维化的过程中发挥重要作用:AMPK可作为ERK的靶点抑制血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ）诱导的心肌成纤维细胞增殖;AMPK可抑制TGF-β诱导的转录下游的激活,进而达到抗纤维化的作用。综上所述,AMPK是糖尿病状态下心肌纤维化的关键信号分子,可能在DCM的发生和发展中起重要作用。因此,能否通过对AMPK通路的调节,实现对心肌纤维化的有效调控,进而遏制DCM的发生呢?但目前关于AMPK信号通路的精确调控机制仍所知甚少。细胞死亡诱导 DFF45 样效应因子（Cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effector protein,CIDE）家族是20世纪末发现的一组能够诱导细胞凋亡的新基因,CIDE家族主要包括CIDEA、CIDEB和CIDEC（在小鼠称为FSP27）。除促凋亡作用外,CIDEC作为糖脂代谢的重要调节因子,与胰岛素抵抗的发生密切相关,是调控2型糖尿病特有的代谢异常的关键分子,为我们源头性干预DCM提供了思路。研究表明脂肪代谢障碍及胰岛素抵抗型糖尿病患者存在CIDEC纯合子的无义突变（E186X）,而且人类CIDEC的表达与胰岛素抵抗指数呈明显的正相关。FSP27-/-小鼠表现出甘油三酯水平降低,脂质代谢速率增加及胰岛素敏感性升高。因此,CIDEC可同时调控糖脂代谢异常及胰岛素抵抗的发生和发展,在2型糖尿病代谢异常的调控中发挥重要作用。此外,CIDEC/FSP27 siRNA转染可恢复AMPK的活性,进一步增加解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）的表达并减少胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein,SREBP）及脂滴包被蛋白的合成。但CIDEC/AMPK信号通路在DCM方面未见报道。综上,AMPK在2型糖尿病状态下的心肌纤维化和能量代谢调节中作用显著,而CIDEC与糖脂代谢密切相关且可调控AMPK信号通路,因此我们提出如下假说:糖尿病状态下CIDEC过表达,并可能通过对AMPK的调控而影响DCM心肌纤维化的进程,但目前尚未见类似报道。鉴于以上假说,本实验将以DCM大鼠为模型,研究CIDEC在DCM发生和发展中的作用;应用CIDEC-shRNA干扰技术特异性抑制CIDEC的表达,在整体水平探讨CIDEC/AMPK信号通路对胶原合成的调控机制以及逆转DCM进程的可行性。研究目的1.建立2型DCM大鼠模型,检测2型DCM大鼠心肌纤维化、心肌肥厚和心功能变化等,探讨CIDEC/AMPK信号通路在DCM发生和发展中的作用;2.应用CIDEC-shRNA腺病毒转染DCM大鼠,观察CIDEC基因沉默后心肌纤维化、心肌肥厚和心功能等的变化,在整体动物水平研究CIDEC基因沉默改善DCM的机制。研究方法1.动物模型的建立及实验动物分组选择5周龄健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠40只,体重140g±20g左右,购自北京维通利华有限公司。适应性喂养1周后（实验开始0周）,行腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）和腹腔胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT）并测定空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）和空腹胰岛素（fasting insulin,FINS）,然后随机分为2组:对照组（n=10）和糖尿病组（n=30）。对照组大鼠喂以基础饲料,主要成分为:3%粗脂肪、3%粗纤维、20%粗蛋白及74%碳水化合物和其他微量元素;糖尿病组大鼠喂以高糖高脂高热量饲料,主要成分为:34.5%脂肪、17.5%蛋白质及48%碳水化合物和其他微量元素。4周（即实验开始4周）后再次行IPGTT及IPITT并测定FBG和FINS,糖尿病组大鼠出现胰岛素抵抗者给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）27.5mg/kg,对照组大鼠给予同等剂量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。各组以原饲料继续喂养1周（即实验开始5周）后,测定FBG和FINS,计算胰岛素敏感指数[ISI,ISI=In（FINS×FBG）-1]。连续两次FBG≥11.1mmol/L,胰岛素敏感性减低,并伴有多饮、多食、多尿现象的大鼠纳入实验。各组以原饲料继续喂养12周（即实验开始17周末）,糖尿病组大鼠继续分为空白对照组（DCM组,n=10）、腺病毒空载体组（DCM+vehicle组,n=10）和CIDEC腺病毒干预组（DCM+CIDEC-shRNA组,n=10）。糖尿病成模后16周（即实验开始21周末）,四组大鼠均施行安乐死,留取标本后称取心脏重量,并计算心脏重量/体重比值。2.血液生化指标的测定采用葡萄糖氧化酶法测定FBG,采用竞争性放免法测定FINS,并计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index,ISI）;同时采用拜耳1650血生化自动检测仪检测血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、甘油三酯（triglyceride,TG）和游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）的水平。3.IPGTT 和 IPITT大鼠禁食12h后行IPGTT,按照1g/kg体重进行腹腔葡萄糖注射,分别于0min,15min,30min,60min和120min采集尾静脉血测量血糖,并计算血糖曲线下面积（area under curve,AUC）。大鼠禁食4h后行IPITT,按照1 unit/kg体重进行腹腔胰岛素注射,余同IPGTT。4.动物模型的超声心动图监测采用二维、脉冲多普勒和组织多普勒技术动态观察DCM发生和发展过程中左心室收缩和舒张功能的变化及心肌间质纤维化的变化,测量左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室短缩率（fractional shortening,FS）和 E/e’。5.血流动力学监测于实验末（实验开始21周末）应用心导管技术测定其左室松弛时间常数,左室±dp/dtmax,左室舒张末压（left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP）和左室收缩压（left ventricular end-systolic pressure,LVSP）。6.心肌胶原形态的定性和定量分析（1）应用天狼猩红染色和Masson染色,观察胶原纤维的分布;（2）应用图象分析仪测定相应的胶原容积分数（CVF%）、心肌血管周围胶原面积和管腔面积比例（PVCA/LA）;（3）采用羟脯氨酸法测定心肌胶原含量（collagen content ug/mg LV weight）;（4）应用免疫组织化学染色观察心肌间质Ⅰ型和Ⅲ型胶原分布;（5）采用Western blot技术测定心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白水平,并计算胶原Ⅰ/Ⅲ比例。7.组织病理学染色（1）左室心肌横截面H＆E染色和Laminin免疫组化染色观察左室心肌细胞大小;（2）油红O染色观察心肌组织中脂质沉积;（3）免疫荧光染色观察左室心肌巨噬细胞标记物CD68的表达;（4）应用免疫组织化学染色法,光镜下观察心肌组织晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）和白介素 6（interleukin-6,IL-6）的表达。8.CIDEC/AMPK途径各关键分子的表达（1）采用实时定量RT-PCR和Western blot技术测定心肌组织CIDEC的mRNA和蛋白表达水平;（2）采用Western blot技术测定心肌组织磷酸化AMPKα和总AMPKα的表达,并计算p-AMPKα/AMPKα的比值,分析AMPKα的磷酸化水平。9.CIDEC腺病毒体内转染实验糖尿病成模后12周（实验开始17周末）,DCM+CIDEC-shRNA组经颈静脉注射CIDEC腺病毒,DCM+vehicle组注射pAdxsi空病毒载体,2周后补充注射一次,CIDEC腺病毒注射4周后（实验开始21周末）施行动物安乐死,留取标本。结果1.2型糖尿病大鼠出现严重的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗（1）高脂喂养4周后各组大鼠生化指标的测定及IPGTT和IPITT实验结果分析:与对照组相比,糖尿病组大鼠血清TC、TG、LDL-C、FBG和FINS开始升高（P＜0.05～P＜0.01）,而ISI则开始降低（P＜0.01）;与基线相比,糖尿病组大鼠在IPGTT和IPITT试验15min、30min、60min和120min的血糖值均明显升高（P＜0.05～P＜0.001）。（2）高脂喂养5周后各组大鼠生化指标的测定及IPGTT和IPITT实验结果分析:与对照组相比,糖尿病组大鼠血清TC、TG、FFA、LDL-C、FBG和FINS明显升高（P＜0.05～P＜0.001）,而ISI则显著降低（P＜0.001）;与基线相比,糖尿病组大鼠在IPGTT和IPITT试验所有时间点的血糖值均明显升高（P＜0.01～P＜0.001）。（3）高脂喂养17周后各组大鼠生化指标的测定及IPGTT和IPITT实验结果分析:与对照组相比,糖尿病组大鼠血清TC、TG、FFA、LDL-C、FBG和FINS进一步升高（P＜0.05～P＜0.001）,而ISI降低更为明显（P＜0.001）;与基线相比,糖尿病组大鼠在IPGTT和IPITT试验所有时间点的血糖值均显著升高（P＜0.01～P＜0.001）。2.2型糖尿病大鼠出现左室收缩及舒张功能障碍（1）糖尿病成模后6周,糖尿病组大鼠LVEDd和E/e’较对照组均有所增加,但仅E/e’的升高具有统计学差异（P＜0.01）,至成模后12周上述改变更为显著,表现为明显的左室心腔扩大和显著的E/e’升高（P＜0.01）;（2）糖尿病成模后12周,与对照组相比,糖尿病组大鼠左室射血分数（LVEF）和左室短缩率（FS）开始出现轻度降低（P＜0.05～P＜0.001）,说明左室收缩功能障碍出现较晚,继发于舒张功能障碍之后,符合DCM的特征;（3）实验末,糖尿病组大鼠左室舒张末期内径（LVEDd）、E/e’和LVEDP较对照组均显著增加（P＜0.05～P＜0.001）,且糖尿病组大鼠左室射血分数（LVEF）及左室短缩率（FS）持续降低（P＜0.001）,提示实验末糖尿病组大鼠同时出现舒张及收缩功能障碍。3.DCM大鼠左室心肌病理性变化（1）与对照组相比,DCM大鼠左室病理性重构明显,表现为左室心腔扩大和室壁增厚;心肌细胞肥大、形态扭曲、排列紊乱,细胞核大小不甚规则,大量心肌纤维断裂,间隙明显增大,心肌组织内胶原组织明显增多,排列紊乱,分布不均,粗大胶原纤维相互连接成网状或团块状,紧密围绕于心肌细胞和小血管周围;（2）DCM大鼠左室心肌组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原均明显增加（P＜0.01）,且Ⅰ型胶原增加更为显著,胶原Ⅰ/Ⅲ比例明显增加（P＜0.001）,导致左室僵硬、顺应性降低;（3）DCM大鼠左室心肌组织内异位脂质沉积明显增多,炎症浸润较为广泛。4.DCM大鼠信号通路蛋白的表达变化与对照组相比,DCM大鼠心肌组织CIDEC mRNA和蛋白表达均显著增高（P＜0.01～P＜0.001）,同时AMPKα磷酸化水平明显下降（P＜0.001）,提示CIDEC/AMPKα信号通路参与DCM的形成与进展。5.CIDEC基因沉默改善DCM的机制研究（1）与DCM+vehicle组相比,CIDEC基因沉默能够逆转DCM大鼠左室病理性重构,表现为扩大的左室心腔减小,室壁变薄;心肌纤维断裂减少,心肌细胞体积及心肌间隙明显变小;紧密围绕于心肌细胞和小血管周围的胶原组织显著减少;（2）与DCM+vehicle组相比,CIDEC基因沉默能够有效地降低DCM大鼠左室心肌组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原含量,且Ⅰ型胶原减少更为显著（P＜0.01）,胶原Ⅰ/Ⅲ比例明显降低（P＜0.001）,从根本上改善了左室顺应性;（3）与DCM+vehicle组相比,CIDEC基因沉默减少了 DCM大鼠左室心肌组织内异位脂质沉积（P＜0.001）,这与CIDEC基因干预后血清各脂质（TC、TG、LDL-C、FFA）含量的下降完全一致;同时基因干预后,CD68、IL-6和AGEs的表达显著降低（P＜0.001）,提示心肌组织内广泛的炎症浸润得到有效缓解;（4）与DCM+vehicle组相比,CIDEC基因沉默能够有效增加心肌组织AMPKα的磷酸化水平（P＜0.01）,减轻糖耐量异常并增加胰岛素敏感性,从而改善糖脂代谢紊乱,同时减少心肌胶原的过度增生,使心肌间质纤维化得到有效改善;（5）超声心动图和心导管结果显示:CIDEC基因沉默后,DCM大鼠LVEDd、E/e’和LVEDP明显降低（P＜0.05～P＜0.001）,左室±dp/dt（max）绝对值明显增加（P＜0.05～P＜0.001）,提示CIDEC基因沉默可显著改善DCM大鼠心脏舒张功能;同时CIDEC基因沉默后,DCM大鼠LVEF和FS有所回升（P＜0.05～P＜0.01）,提示CIDEC基因沉默同时改善了 DCM大鼠心脏收缩功能。结论1.DCM大鼠发生显著的糖脂代谢紊乱,具有胰岛素抵抗、高血糖及高血脂的特点,基本符合2型糖尿病的临床特点;2.DCM大鼠以左室舒张功能障碍为主要表现,继发收缩功能不全;3.DCM大鼠出现心肌纤维化、心肌肥厚、异位脂质沉积和炎症,同时伴心肌组织CIDEC表达增加,提示CIDEC参与DCM病理进程;4.CIDEC表达上调,进而抑制AMPKα磷酸化引起Ⅰ、Ⅲ型胶原合成显著增加,最终导致心肌纤维化,是2型DCM发生和发展的重要分子机制;5.CIDEC基因沉默可通过上调AMPKα磷酸化,减少心肌组织胶原Ⅰ、Ⅲ合成、减轻心肌纤维化,从而改善DCM大鼠左室收缩和舒张功能;6.CIDEC基因沉默可减轻DCM大鼠糖脂代谢紊乱、心肌肥厚、心肌异位脂质沉积和炎症。研究背景糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）是一种由糖尿病引起的独立于糖尿病大血管并发症的心肌结构和功能改变的疾病,与糖尿病特有的代谢异常有关。临床研究表明,DCM通常以舒张性心力衰竭为早期表现,心肌纤维化正是舒张性心力衰竭的主要发生机制,随着心肌胶原浓度的增加,亦可导致收缩功能受损;提示心肌纤维化在DCM的发生和发展中起着举足轻重的作用。尽管糖尿病引起的心肌纤维化增加了 DCM发病率和死亡率,但无有效的治疗策略来改善或逆转心力衰竭。因此,深入研究DCM时心肌纤维化的深层机制,寻找同时改善糖代谢和减轻心肌纤维化的共有途径成为目前防治DCM亟待解决的关键问题。DCM抗纤维化治疗的一个潜在细胞靶点是心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts,CFs）,它是纤维化过程中的最终效应细胞,在心肌纤维化的进程中起到至关重要的作用。然而,对心肌成纤维细胞内在干预靶点的筛选仍是一个不断研究的领域。我们在整体动物水平已发现CIDEC与DCM心肌纤维化密切相关。DCM大鼠出现了明显的心肌纤维化,Ⅰ、Ⅲ型胶原比例升高;同时伴随心肌组织CIDEC表达升高及AMPKα磷酸化水平降低;而CIDEC基因沉默可通过上调AMPKα磷酸化水平,减轻心肌纤维化。所以CIDEC/AMPKα信号通路可能介导了 DCM心肌纤维化的进程;但在细胞水平,CIDEC是否为CFs内胶原合成的潜在干预靶点,CIDEC/AMPKα在CFs中的定位及相互作用方式如何等,诸多深层机制问题仍需我们进一步探讨。最初CIDEC基于与DNA裂解因子的同源性,被鉴定为凋亡蛋白。然而,最近的研究将其重新定义为调节脂滴动力学和脂肪代谢的相关蛋白,有助于人类健康的代谢表型,与代谢平衡密切相关。CIDE蛋白诱导细胞凋亡和DNA片段裂解,必须定位于线粒体。而Puri等发现CIDEC在脂肪细胞中高表达,并定位在脂滴上,在脂代谢中发挥着关键作用,因此被认为是脂滴相关蛋白。另有研究推测CIDEC还可能存在于内质网中。但在胰岛素抵抗状态下,CIDEC在CFs中的亚细胞定位及功能如何尚不清楚。前期在整体动物水平我们发现CIDEC可调控AMPKα,但在胰岛素抵抗的CFs胶原合成过程中CIDEC如何介导AMPKα发挥作用,作用于哪种亚基类型呢?在结构上AMPK是一个由催化亚基（α亚基）和调节亚基（β和γ亚基）组成的异源三聚体蛋白。其中α亚单位在N端含有激酶结构域,为催化亚基,有α1和α2两个亚型。Salt I等对其亚细胞定位的研究发现位于细胞核内的大部分是α2亚型而不是α1亚型AMPK复合体,提示AMPKα2复合体可能参与基因表达的直接调控。研究表明AMPKα2可调控血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ）诱导的腹主动脉瘤的胶原合成,而且是二甲双胍减轻心肌纤维化的靶点。那么,AMPKα2是否在胰岛素抵抗的CFs胶原合成过程中发挥作用呢?但目前为止AMPKα各亚基在CFs中的亚细胞定位和作用机制尚不清楚。综上推测CIDEC/AMPKα信号通路可能在胰岛素抵抗的CFs胶原合成中发挥重要作用,但二者在CFs中的亚细胞定位、相互作用方式及如何调控胶原合成尚不明确。我们以胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞为模型,研究CIDEC和AMPKα的相互作用、亚细胞定位以及CIDEC/AMPKα信号通路在胶原合成中的作用;应用CIDEC-shRNA腺病毒转染技术特异性抑制CIDEC的表达,在细胞水平探讨CIDEC基因沉默对胶原合成的调控机制。研究目的1.建立胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞模型,从细胞水平研究CIDEC在胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞胶原合成中的作用;2.探究AMPKα不同亚型在心肌成纤维细胞内的亚细胞定位以及与CIDEC的相互作用;3.构建大鼠CIDEC重组腺病毒载体转染心肌成纤维细胞,从细胞水平研究CIDEC/AMPKα信号通路在胶原合成中的重要作用。研究方法本研究以原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞为研究对象,应用实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）、细胞免疫荧光单标和双标技术、Duolink? In Situ PLA、免疫共沉淀（Co-IP）和腺病毒转染等实验技术,分别观察:1.采用高糖和高胰岛素共同刺激诱导建立胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞模型,体外模拟2型糖尿病胰岛素抵抗状态,分为正常糖组（5.5mmol/L）和胰岛素抵抗组（15mmol/L葡萄糖+104μU/ml胰岛素）检测心肌成纤维细胞CIDEC mRNA和蛋白表达水平、AMPKα磷酸化水平以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量;2.体外模拟2型糖尿病胰岛素抵抗状态,分为正常糖组和胰岛素抵抗组观察心肌成纤维细胞CIDEC核转位、CIDEC与AMPKα各亚型的细胞内定位、CIDEC与 AMPKα1+α2 的共定位以及 CIDEC 与 AMPKα1+α2、CIDEC 与 AMPKα2 的相互作用;3.构建CIDEC过表达腺病毒（Flag+GFP标记）体外转染原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞,应用免疫共沉淀（Co-IP）技术检测CIDEC与AMPKα1+α2以及CIDEC与AMPKα2的蛋白质间的生物学相互作用;4.构建CIDEC shRNA腺病毒（GFP标记）体外转染正常糖组和胰岛素抵抗组原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞,抑制CIDEC mRNA和蛋白表达,观察胰岛素抵抗对AMPKα磷酸化水平以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的影响;5.在正常糖组、胰岛素抵抗组和胰岛素抵抗+CIDEC ShRNA组,加入AMPK抑制剂compound C,抑制AMPKα磷酸化,观察AMPKα磷酸化激活被抑制后,CIDEC shRNA腺病毒转染对正常和胰岛素抵抗的原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的影响。结果1.建立胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞模型高糖高胰岛素刺激48h后,心肌成纤维细胞的IRS-1蛋白表达水平和Akt磷酸化水平明显降低;生理剂量胰岛素刺激后,Glut4膜转位和葡萄糖摄取减少。上述结果表明我们成功构建了胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞模型。我们还观察到胰岛素抵抗刺激促进心肌成纤维细胞CIDEC mRNA和蛋白表达,CIDEC mRNA在刺激后24小时达到峰值（P＜0.001）,而CIDEC蛋白水平在刺激后48h达到高峰（P＜0.01）,结果说明胰岛素抵抗刺激48h成功诱导胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞模型的同时,促进CIDEC蛋白表达的效应也最为显著,故将胰岛素抵抗刺激48h作为诱导胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞模型的条件。2.胰岛素抵抗促进心肌成纤维细胞胶原合成和比例失调与正常糖组相比,胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达显著增加（P＜0.001和P＜0.05）,同时胶原Ⅰ/Ⅲ的比例也显著升高（P＜0.001）,说明胰岛素抵抗促进心肌成纤维细胞的胶原合成并升高胶原Ⅰ/Ⅲ比例。3.胰岛素抵抗抑制心肌成纤维细胞AMPKα磷酸化激活与正常糖组相比,胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞AMPKα磷酸化水平明显下调（P＜0.001）,说明胰岛素抵抗抑制心肌成纤维细胞AMPKα磷酸化激活。4.胰岛素抵抗促进心肌成纤维细胞CIDEC核转位与正常糖组相比,胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞核蛋白中的CIDEC蛋白表达显著增加（P＜0.001）,而胞浆蛋白中的CIDEC蛋白表达则显著降低（P＜0.05）;免疫荧光检测其阳性表达的IOD结果与之相符,且其阳性表达的核浆比升高了 1.13倍（P＜0.001）。以上结果说明胰岛素抵抗状态下心肌成纤维细胞核中的CIDEC增多而细胞浆中的CIDEC减少,提示胰岛素抵抗促进CIDEC发生核转位。5.AMPKα不同亚型在胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞内的定位和表达变化（1）AMPKα1+α2在胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞中的定位和表达变化与正常的心肌成纤维细胞相比,AMPKα1+α2在胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞浆中减少（P＜0.05）,而在细胞核中增加（P＜0.05）,进一步分析其核浆比显著升高（P＜0.05）,结果说明胰岛素抵抗状态下心肌成纤维细胞核中的AMPKα1+α2增多而细胞浆中的AMPKα1+α2减少,与CIDEC的变化一致;（2）AMPKα1在胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞中的定位和表达变化无论正常和胰岛素抵抗条件下,AMPKα1均主要分布于心肌成纤维细胞的细胞浆中,然而与正常糖组相比,胰岛素抵抗组AMPKα1在细胞浆中的水平降低（P＜0.05）,说明胰岛素抵抗使其减少;（3）AMPKα2在胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞中的定位和表达变化无论正常和胰岛素抵抗条件下,AMPKα2几乎完全分布于心肌成纤维细胞的细胞核中,然而与正常糖组相比,胰岛素抵抗组AMPKα2在细胞核中的水平显著升高（P＜0.001）,说明胰岛素抵抗使其增多。6.CIDEC与AMPKα1+α2在心肌成纤维细胞内的相互作用及其定位（1）Co-IP结果显示:CIDEC与AMPKα1+α2可在心肌成纤维细胞中相互结合并发生直接的生物学相互作用;（2）Duolink? In Situ PLA进一步分析其相互作用的强度和细胞内定位结果显示:与正常糖组相比,在胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞中CIDEC与AMPKα1+α2相互作用阳性区域的IOD在细胞浆中显著减少（P＜0.05）,却在细胞核中显著增加（P＜0.001）,且核浆比也明显增加（P＜0.001）;（3）免疫荧光双标结果显示:CIDEC与AMPKα1+α2在胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞中重叠区域（共定位）的分布和面积变化与Duolink? In Situ PLA结果一致。7.CIDEC与AMPKα2在心肌成纤维细胞内的相互作用及其定位（1）Co-IP结果显示:CIDEC与AMPKα2可在心肌成纤维细胞中相互结合并发生直接的生物学相互作用;（2）Duolink? In Situ PLA进一步分析其相互作用的强度和细胞内定位结果显示:与正常糖组相比,在胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞中CIDEC与AMPKα2相互作用的阳性区域均分布在细胞核中,且其IOD显著增加（P＜0.001）,结果说明,胰岛素抵抗状态下,CIDEC与AMPKα2的相互作用增强,并发生在心肌成纤维细胞的细胞核中。8.CIDEC/AMPKα信号通路参与调控胰岛素抵抗诱导的心肌成纤维细胞胶原合成和比例失调（1）应用CIDEC-shRNA腺病毒转染胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞,CIDEC的mRNA和蛋白表达水平显著降低,其中蛋白水平下降了约70%,说明CIDEC-shRNA腺病毒转染有效抑制了胰岛素抵抗诱导的心肌成纤维细胞CIDEC蛋白表达;（2）降低CIDEC的表达之后,我们发现:胰岛素抵抗组心肌成纤维细胞AMPKα磷酸化水平升高了 2.89倍,伴随着胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白表达水平和胶原Ⅰ/Ⅲ比例显著降低,以Ⅰ型胶原蛋白和胶原Ⅰ/Ⅲ比例降低最为明显,降低了约50%,结果提示:CIDEC-shRNA转染可上调心肌成纤维细胞AMPKα磷酸化水平,并可降低胶原Ⅰ、Ⅲ合成和胶原Ⅰ/Ⅲ比例。（3）为了进一步证实CIDEC通过抑制AMPKα磷酸化促进胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞胶原合成和比例失调,我们在CIDEC-shRNA转染前加入AMPK抑制剂compound C（cC）。结果显示:与胰岛素抵抗+CIDEC-shRNA组相比,胰岛素抵抗+CIDEC-shRNA+cC组心肌成纤维细胞AMPKα磷酸化水平显著降低（P＜0.01）,伴随着Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成增加以及胶原Ⅰ/Ⅲ比例显著升高（P＜0.05～P＜0.01）,说明AMPK抑制剂cC可以抵消CIDEC基因沉默降低胶原合成和缓解胶原比例失调的作用。结论1.胰岛素抵抗的心肌成纤维细胞CIDEC表达升高并发生核转位,位于细胞核中的CIDEC可直接作用于AMPKα2;2.CIDEC可能通过抑制AMPKα的活性,导致胶原Ⅰ、Ⅲ合成增加和比例失调;3.CIDEC基因沉默可通过激活AMPKα信号通路,减少心肌成纤维细胞胶原Ⅰ、Ⅲ合成,降低胶原Ⅰ/Ⅲ比例。