论文部分内容阅读
甲硫氨酸(methionine, Met)是多肽和蛋白质中重要的含硫氨基酸残基。Met易被臭氧、过氧化氢及羟自由基等活性氧氧化成为甲硫氨酸-R,S-亚砜(Met-R, S-SO),它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失。甲硫氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase, MSR)可以将生物体内的甲硫氨酸_R,S-亚砜还原为甲硫氨酸,使其所在蛋白质重新恢复活性。目前已知的MSRs有甲硫氨酸亚砜还原酶A (MSRA),甲硫氨酸亚砜还原酶B (MSRB)和fR型甲硫氨酸亚砜还原酶(fRMSR)三种,其中MSRA特异性地还原游离的和蛋白质中的S型甲硫氨酸亚砜,MSRB可以特异性地还原蛋白质中的R型甲硫氨酸亚砜,也可低效率地还原游离的R型甲硫氨酸亚砜,fRMSR特异性催化还原游离的R型甲硫氨酸亚砜。土壤重金属对植物的危害问题已引起广泛关注,重金属在植物内大量积累严重影响植物的生长发育。植物体在适应环境的过程中,逐渐形成了一系列的适应性机制。铜(Cu)是主要的土壤重金属之一,具有氧化还原特性,过量Cu容易引起植物的氧化胁迫和活性氧(ROS)积累。本实验室利用2D-PAGE技术,发现Cu胁迫引起了水稻甲硫氨酸亚砜还原酶(OsMSR)的表达显著增加,这说明OsMSRs可能参与了水稻对铜胁迫的响应。水稻中有7个OsMSRs基因,本实验通过RT-PCR方法克隆获得水稻OsMSRA2.1和OsMSRB5基因,其阅读框分别为564和411bp,分别编码187和136个氨基酸。对其序列进行生物信息学分析,发现两个基因编码的氨基酸序列均高度保守,且均与高梁SbMSR和玉米ZmMSR的同源性较高。对水稻中OsMSRs基因家族7个成员进行组织表达分析发现,OsMSRA2.1在根、茎、叶中表达量均很高,在种子中表达量较低,OsMSRA4、OsMSRB1.1、OsMSRB1.2在茎、叶中表达量较高,在根及种子中的表达量较低；OsMSRA5基因在根中表达量最高；OsMSRB5基因在叶中表达量最高。诱导表达特性研究表明,短时间过量Cu处理会降低OsMSRs基因的表达,但是随着胁迫时间的延长,OsMSRs基因的表达逐渐恢复。同时还发现甲基紫精(methyl viologen)能够诱导OsMSRA2.1和OsMSRB5的上调表达,特别是在根系中。将水稻OsMSRA2.1和OsMSRB5两个基因编码区构建到原核表达载体pET-30a中,将重组质粒pET-30a-MSRA2.1和pET-30a-MSRB3转化到大肠杆菌中使其诱导表达,研究转基因大肠杆菌在Cu和甲基紫精胁迫条件下的生长状况,发现重组菌的生长情况优于对照菌,表明其对Cu和甲基紫精的耐性增强。为了研究OsMSRA2.1和OsMSRB5突变体与野生型基因功能的差别,本实验室购买OsMSRA2.1和OsMSRB5的T-DNA插入缺失突变体1E-01019.L和3D-00669.R,对两种突变体进行基因型鉴定,发现同时含有野生型、杂合体和纯合体,纯合体分别为3株和4株,鉴定完成后将突变株移入田间繁种备用。