研究背景：　　大脑是一个高度分布式系统，神经网络的同步振荡活动能将不同脑区在功能上联系起来，实现多脑区的协同工作。基底神经节（Basal ganglion，BG）-皮层环路广泛存在β节律（13-30 Hz）的网络振荡并具有重要生理功能，帕金森病、亨廷顿病等多种神经疾病均发现BG-皮层环路振荡异常。神经网络振荡活动的机制之一是神经元的膜共振，即神经元对某一特定频率响应尤其敏感的现象。皮层、海马部位神经元均存在共振现象并广泛参与神经网络振荡节律的形成。既往研究发现，纹状体参与了BG-皮层环路中神经网络振荡的形成，但是其具体机制目前尚不明确。前期研究表明，丘脑底核神经元共振与BG-皮层环路中神经振荡密切相关，因此我们认为纹状体神经元可能同样存在共振现象并参与BG-皮层环路神经网络振荡，但目前背侧纹状体MSNs是否存在共振尚无报道。　　作为BG的主要传入核团，背侧纹状体与运动控制、执行功能以及学习等生理过程相关。纹状体投射神经元为中等多棘神经元（medium-sized spiny neurons，MSNs），主要包括表达多巴胺D1受体的D1 MSNs及表达D2受体的D2 MSNs。D1 MSNs发出的纤维参与构成直接通路，D2 MSNs发出的纤维参与构成间接通路。生理情况下，多巴胺通过 D1及 D2受体维持两条通路功能动态平衡。由于膜共振参与调节神经元放电以及树突整合过程，因此多巴胺可能通过改变MSNs共振特性影响纹状体神经元放电模式或树突整合功能进而导致直接通路与间接通路之间出现功能失衡，但其具体机制目前尚不明确。　　本课题选择背侧纹状体MSNs作为研究对象，利用D1-Tdtamato和D2-eGFP转基因小鼠活体区分D1 MSNs及D2 MSNs，研究其共振现象及离子机制，并深入探讨多巴胺对直接通路及间接通路MSNs共振的调节作用的离子机制与信号通路，结果将有助于进一步揭示BG-皮层环路中网络振荡的形成机制和潜在的病理调节作用。　　实验目的：　　（1）研究背侧纹状体两类MSNs是否有共振现象及其特征；　　（2）探讨两类MSNs共振的离子机制；　　（3）研究多巴胺D1、D2受体对两类MSNs Kir电流的影响及信号转导途径；　　（4）探讨多巴胺受体对两类MSNs膜共振及突触传递功能的影响。　　实验方法：　　（1）脑片准备及电生理记录　　使用D1-Tdtomato及D2-eGFP转基因小鼠（4-6周），制作含有纹状体的冠状脑片（厚300μm），根据荧光确定D1或D2 MSN，进行全细胞记录。选择串联电阻小于20 MΩ、静息电位负于-60 mV、动作电位有超射的神经元进行记录。　　（2）MSNs共振的记录及分析　　在全细胞电流钳模式下，将细胞钳制于不同膜电位（-70mV、-100mV及-120mV），给予细胞一个振幅固定、频率随时间线性增大的正弦电流（ impedance amplitude profile，ZAP）刺激（时程10s，频率0-200Hz），记录神经元的电压反应。如神经元在某一个特定频段电流刺激的电压反应最强，即代表出现共振现象，此时在该频段电压表现出明显的共振峰，此共振峰所对应的频率即为神经元的共振频率（fres）。将实验中记录到的电压反应与ZAP电流进行FFT后相除得到阻抗曲线，读出fres及阻抗值。　　（3）MSNs树突时间整合的记录及分析　　将刺激电极放置于胼胝体内侧靠近背侧纹状体边缘的位置。在电流钳模式下将细胞钳制于-70mV，利用电刺激器和隔离器通过输出一个恒定电流作用于MSNs。此电流由5个时长为100μs、频率40Hz的脉冲构成，可以诱发出频率为40Hz的5个连续的EPSP。以第5个EPSP幅度与第1个EPSP幅度的比值作为衡量树突时间整合的标准。　　（4）MSNs树突空间整合的记录及分析　　利用LabView7.0图形化编程软件产生一个随机的噪声刺激电流（时长10s，滤波50KHz），电流刺激强度为基强度的1.5-2.0倍。观察此强度下细胞对噪声刺激的放电反应，计算即时放电频率，以此作为评估神经元树突空间整合的指标。　　（5）给药方式　　除DL-AP5（NaOH，1eq）以及Quinpirole（去离子水）外，其余药品均使用DMSO作为溶剂配制。储存浓度为终浓度的1000倍，使用时按1:1000比例加入外液，DMSO终浓度小于0.1％。某些试验中，neurobiotin350及Adenosine加入电极内液。　　（6）统计学处理　　采用SPSS19.0进行分析，实验结果用均值±标准误（x±SEM）表示。两组间均数的比较采用单样本t检验或者配对样本t检验。多组间的数据用One-way ANOVA或Two-way ANOVA进行比较，两两之间用LSD方法进行比较，如P<0.05则认为有统计学差异。　　实验结果：　　（1）MSNs的阈下膜共振及其电压依赖性　　在28℃条件下，分别将细胞膜电位钳制于-70mV、-100mV及-120mV，给予ZAP电流刺激。静息状态下（-70mV）未记录到共振峰。当膜电位超级化至-100mV时， MSN电压出现共振峰，有膜共振现象产生。钳制电位为-120mV时，MSN电压反应呈明显梭型，共振现象较-100mV更加明显。当膜电位超级化幅度逐步增大时，共振频率逐步升高（-70mV,0 Hz, n=3；-100 mV,11.7±0.39 Hz，n=5；-120 mV,17.8±0.60 Hz, n=5），共振幅度逐步减小（-70mV，101.0±12.66 MΩ，n=3；-100 mV，68.4±12.8 MΩ，n=5；-120 mV,49.7±6.39 MΩ，n=5）。　　钳制电位为-100mV时，两类MSNs记录到明显共振峰，共振频率位于10-20Hz之间（D1 MSNs：15.3±0.56 Hz；D2 MSNs：14.5±0.67 Hz），均属于β频段。D1及D2 MSNs之间在共振阻抗及fres方面均无统计学差异。　　（2）MSNs共振由Kir电流介导　　膜电位超级化时D1 MSNs及D2 MSNs均被诱导出快速激活的内向离子流。此电流具有明显的内向整流特性，可被BaCl2阻断，结合以往研究，表明所记录的电流为Kir电流。两类MSNs之间Kir电流幅度及衰减时间无统计学差异。阻断Kir电流后两类MSNs共振均消失。Kir的幅度受细胞外K+浓度调节，细胞外K+浓度升高时，Kir幅度增大，细胞fres也随之升高。　　（3）多巴胺对两种类型MSNs Kir电流及共振具有双向调节作用　　多巴胺D1受体激活后D1 MSN Kir电流幅度增大，共振峰右移，fres增大，共振幅度减小，阻断D1受体后上述作用消失。D2受体激活后D2 MSN Kir电流幅度减小，共振峰左移，fres降低，共振幅度增大，阻断D2受体后上述作用消失。多巴胺受体激动剂对D1及D2 MSNs共振及Kir电流的作用是可逆的，不会被胆碱能M1及M4受体阻断剂所阻断。预先阻断Kir电流后，D1及D2受体激动剂对电流及共振的调节作用均消失。　　（4）多巴胺对MSNs树突时间整合的影响　　加入D1受体激动剂SKF83822后刺激电极诱发的EPSP幅度与加药前相比降低,第5个EPSP幅度与第1个EPSP幅度的比值降低（加药前：1.4±0.10；SKF83822：1.2±0.07;n=7,P<0.01）。应用Quinpirole孵育D2 MSN后，各个EPSP幅度均不同程度增大，第5个EPSP幅度与第1个EPSP幅度的比值明显升高（加药前：1.4±0.21；Quinpirole：1.9±0.42, n=7, P<0.05）。SKF83822及Quinpirole对第一个EPSP幅度均无明显影响。　　（5）多巴胺对MSNs树突空间整合的影响　　膜电位为-70mV时，两类MSNs均出现随机放电，平均即时放电频率均在13Hz左右，与MSNs共振频率同属β频段。应用SKF83822孵育细胞后，D1 MSNs放电频率并没有明显改变（加药前：13.3±1.76 Hz；SKF83822,13.7±2.06 Hz；n=5, P>0.05）。但是SKF83822使D1 MSNs基强度降低。当依照新的刺激强度给予噪声刺激时，D1 MSNs放电频率明显降低（加药前：13.9±1.31 Hz；SKF83822：13.9±1.75 Hz；SKF83822（新强度）：7.5±1.2 Hz, n=6;P<0.001）。　　应用Quinpirole孵育D2MSNs后，-70mV时细胞放电频率明显增加（加药前，12.7±1.49 Hz；Quinpirole，17.8±1.65 Hz；n=8，P<0.01）。　　（6）多巴胺调节MSNs Kir电流的分子机制　　激活PKA通路可模拟D1受体激活后增强D1 MSN Kir电流的效应，PKA通路阻断剂则可阻断D1受体激动剂的作用。激活PKC通路可模拟D2受体激动剂抑制D2 MSN Kir电流的效应，而阻断PKC通路及PLC通路均可以阻断D2受体激动剂的作用。细胞内PIP2含量减少后，D1受体及D2受体对Kir电流的调节作用均消失。　　结论:　　本课题利用转基因小鼠及全细胞膜片钳技术，首次对背侧纹状体MSNs共振特性、离子机制以及DA对MSNs共振特性的调节进行了研究。实验结果证实：背侧纹状体MSNs存在由Kir电流介导的β节律共振，此共振具有电压依赖性及细胞外K+浓度依赖性。D1受体通过cAMP-PKA通路发挥调节作用，使D1 MSNs Kir电流幅度增加，共振频率提高，共振幅度降低，树突整合能力下降；D2受体通过PLC-PKC通路使D2 MSNs Kir电流幅度减小，共振频率降低，共振幅度增高，树突整合能力上升。两者共同作用使MSNs的放电频率保持在一个合理的范围之内，从而维持直接通路与间接通路之间的功能动态平衡。此结果将有助于进一步揭示BG-皮层环路中网络振荡的形成机制，以及其在病理过程中的作用。