论文部分内容阅读
慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是对人类健康造成巨大威胁的慢性疾病之一,已成为人们十分关注的公共卫生问题。中药茯苓（Poria cocos）具有利水渗湿、健脾宁心等功效,现在临床上广泛用于治疗CKD。研究表明,肠道菌群失调加重肾损伤,肠道菌群作为肠源性尿毒素的主要来源在CKD的发展过程中发挥着重要的作用,肠道菌群产生的代谢产物通过破坏肠道上皮屏障进入血液循环,产生局部或全身炎症。因此,本研究探讨茯苓对肠道菌群失调和代谢产物紊乱干预作用。目的:基于16S r RNA基因测序和非靶向代谢组学技术,鉴定5/6肾切除（5/6Nephrectomy,NX）诱导CKD大鼠模型中存在显著差异的肠道菌群和血清代谢产物,探讨CKD大鼠肠道菌群与血清代谢产物之间的关系。研究茯苓乙醇提取物（Ethanol extract of poria cocos,PC）及其主要成分茯苓酸A（Poricoic acid A,PAA）对鉴定的菌群相关代谢产物、肠道上皮屏障、炎症与氧化应激等影响,本研究为揭示茯苓抗肾纤维化提供理论参考和科学依据,为茯苓临床治疗CKD提供科学参考。方法:1.CKD大鼠中肠道菌群结构和组成的改变。采用NX诱导的CKD大鼠模型,收集各组大鼠24小时尿液、血液和结肠内容物,测定各组大鼠的血压、尿蛋白和血清肌酐等生理生化指标。对结肠内容物样本进行16S r RNA测序得到肠道微生物组的数据。基于多样性分析、物种组成分析、相关性分析等分析方法研究CKD大鼠肠道菌群的改变。通过PICRUSt代谢功能预测分析研究CKD大鼠改变的肠道菌群潜在的功能影响。2.CKD大鼠中微生物组学和血清代谢组学关联性分析。基于超高效液相色谱-高清质谱联用（UPLC-HDMS）技术,鉴定CKD大鼠血清中的差异代谢产物。通过相关性分析探讨与肠道菌群失调相关的差异代谢产物与收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和肌酐清除率（Creatinine clearance,CCr）之间的关系,并锁定相关代谢通路。3.PAA和PC干预对CKD大鼠的改善作用。使用PAA和PC对CKD大鼠进行干预。通过靶向代谢组学技术对相关代谢通路的代谢产物进行分析,研究PAA和PC对相关代谢通路的代谢产物紊乱的影响。采用Western blot对各组大鼠结肠组织中ZO1、Occludin等紧密连接蛋白的表达,和肾脏组织中调节促炎症的IκBα/NF-κB信号通路和抗炎的Keap1/Nrf2信号通路相关蛋白的表达进行检测。通过组织病理学分析（PAS、Masson’s trichrome和免疫组织化学染色）,探究PAA和PC对各组大鼠肾脏损伤和α-SMA、Vimentin和Collagen I促纤维化因子在肾脏组织中表达的影响。结果:1.NX导致大鼠结肠内菌群改变。与假手术组相比,NX大鼠中Allobaculum、Blautia、Pseudomonas和Clostridium＿IV等13个属水平菌存在显著差异。基于Cytoscape软件分析表明这13个属水平菌与SBP、CCr、血清肌酐等生理生化指标的改变存在显著的相关性,且改变的肠道菌群与氨基酸代谢、核苷酸代谢、脂质代谢等33个代谢途径相关。2.NX导致大鼠血清代谢产物水平发生改变。通过UPLC-HDMS技术,鉴定出甘氨酸、精胺、亚精胺等291个差异代谢产物。这些代谢产物主要参与脂肪酸代谢、氨基酸代谢、多聚胺代谢、嘌呤代谢等。3.NX大鼠肠道菌群失调与血清代谢产物紊乱存在相关性。甘氨酸、精胺、亚精胺等36个代谢产物与Allobaculum、Blautia、Pseudomonas和Clostridium＿IV等13个属水平的差异菌显著相关。16个代谢产物与SBP显著相关,其中甘氨酸、马尿酸、苯丙氨酸等10个代谢产物与甘氨酸代谢相关。15个代谢产物与CCr显著相关,其中腐胺、精胺、亚精胺等7个代谢产物为多聚胺代谢产物。基于SBP、CCr和血清肌酐等9个生理生化指标、13个属水平菌、7个甘氨酸代谢产物和6个多聚胺代谢产物的相关性网络分析表明,NX大鼠中甘氨酸代谢和肠道菌群失调与SBP存在一定的相关性;多聚胺代谢和肠道菌群失调与CCr存在一定的相关性。4.PAA和PC对NX大鼠中失调菌群相关的代谢产物紊乱具有改善作用。PAA和PC干预改善NX大鼠血清中甘氨酸代谢和多聚胺代谢异常、减轻肠道屏障的破坏,调节促炎症的IκBα/NF-κB信号通路和抗炎的Keap1/Nrf2信号通路而抑制炎症与氧化应激。组织病理学分析表明,PAA和PC干预对NX诱导的肾间质炎性细胞浸润、肾小管萎缩/扩张和促纤维化因子的上调具有显著的抑制作用。且相较于PC,PAA具有更强的抗肾间质纤维化效应。结论:本研究表明NX导致大鼠结肠中菌群失调和血清中甘氨酸和多聚胺代谢产物紊乱,且失调的肠道菌群与甘氨酸和多聚胺代谢产物相关。PAA和PC干预NX大鼠可调节微生物失调,减轻氧化应激与炎症和肾纤维化,从而延缓肾功能的下降。