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目的：本研究旨在明确：1、观察高糖培养的血管内皮细胞神经酰胺及NO的浓度变化；2、神经酰胺是否与高糖引起的血管内皮细胞胰岛素IRS-1/PI3K/PKB (Akt)/eNOS信号通路的下调有关；3、抑制神经酰胺的合成能否改善高糖引起的/PKB/eNOS的活性降低以及内皮功能的紊乱；4、抑制神经酰胺降解是否加重血管内皮细胞PKB/eNOS信号通路抑制,使NO的合成减少。方法：1、实验分组：(1)低浓度(5mM)和高浓度(30mM)D-葡萄糖培养HUVECs4、8、12、16和24小时对细胞内神经酰胺及NO浓度的影响；(2)不同浓度5、10、20、30mM D-葡萄糖培养HUVECs细胞16小时后,细胞内神经酰胺及NO浓度的变化；(3)不同浓度(5、10、20、30mM)D-葡萄糖培养的HUVECs细胞给予50nM胰岛素刺激后,测定细胞内NO浓度的变化；(4)30mM D-葡萄糖培养HUVECs细胞16小时,测定内皮细胞上IRS-1、PI3K、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化；(5)分别给予神经酰胺合成途径的特异性抑制剂50μM Myriocin或2μM DES后,测定30mM D-葡萄糖培养的HUVECs细胞内神经酰胺浓度、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化和NO的变化；(6)分别给予抑制神经酰胺降解途径的特异性抑制剂150μMNOE或50μM PDMP后,测定30mM D-葡萄糖培养的HUVECs细胞内神经酰胺浓度、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化和NO的变化；(7)给予30mMD-葡萄糖培养的HUVECs细胞50nM胰岛素刺激后,分别加入50μM Myriocin、2μM DES、150μM NOE或50ΜM PDMP,测定细胞内神经酰胺浓度、Akt、eNOS蛋白表达及Akt、eNOS磷酸化蛋白的变化和NO的变化。2、方法：采用高浓度D-葡萄糖培养HUVECs;液相色谱-质谱联用法测定细胞神经酰胺浓度；Western blot法检测血管内皮细胞中IRS-1, PI3K, Akt和eNOS表达；重氮还原法测定NO合成。结果1.和低糖组相比,高糖组(30mM D-葡萄糖)培养的HUVECs内皮细胞内神经酰胺浓度随时间的延长呈逐渐增加的趋势,在16小时时神经酰胺浓度达最高值,NO浓度随时间延长呈逐渐递减的趋势,在24小时降低最明显；高糖组培养的HUVECs细胞内神经酰胺的浓度的升高和NO浓度减少具有时间依赖性(P<0.05),L-葡萄糖对血管内皮细胞神经酰胺浓度无显著影响(p>0.05)。2.与低糖组相比较,10、20、30mM D-葡萄糖培养HUVECs细胞均能引起细胞内神经酰胺浓度的增加和NO水平的下降(p<0.05),内皮细胞内神经酰胺的积聚和NO浓度下降具有浓度依赖性(p<0.05)。3.50nM胰岛素培养HUVECs细胞4、8、12、16小时,NO浓度显著升高,在4小时NO浓度达到最高值后呈下降趋势,24小时NO浓度降至最低。50nM胰岛素刺激16小时,10mM、20mM和30mM D-葡萄糖培养HUVECs细胞NO浓度均显著下降,NO浓度与D-葡萄糖浓度成反比。4.给予HUVECs细胞50nM胰岛素刺激16小时后,IRS-1、PI3K、 PKB.eNOS蛋白表达水平增高；与低糖组相比,高糖抑制PKB、eNOS磷酸化蛋白的表达,高糖对PKB、eNOS、总蛋白表达无影响(p<0.05)。5.神经酰胺基础合成阻断剂Myriocin或DES可以阻断高糖诱导的细胞神经酰胺积聚,改善高糖对胰岛素信号传导的抑制和内皮功能的紊乱。增加PKB、eNOS磷酸化蛋白表达,使NO的浓度升高(p<0.05)。6.神经酰胺降解阻断剂NOE或PDMP能使血管内皮细胞神经酰胺浓度增加,NOE使高糖引起的PKB、eNOS磷酸化蛋白表达下降更明显,同时降低NO的浓度(p<0.05)。结论1、高糖诱导人脐静脉血管内皮细胞神经酰胺的积聚,神经酰胺浓度的增高具有时间依赖性和浓度依赖性；L-葡萄糖对人脐静脉血管内皮细胞神经酰胺浓度无显著影响；2、高糖可以抑制人脐静脉血管内皮细胞胰岛素PKB/eNOS信号通路的传导和引起内皮功能的紊乱；神经酰胺可能介导了高糖引起的血管内皮细胞功能紊乱；3、神经酰胺合成途径的特异性抑制剂myriocin和DES可阻断高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞神经酰胺积聚,改善高糖培养的内皮细胞PKB/eNOS的活性,使NO生成增加；4、神经酰胺降解特异性阻断剂NOE和PDMP抑制神经酰胺降解,加重高糖引起的PKB/eNOS的活性的下降,使NO生成降低；5、神经酰胺参与了高糖对人脐静脉血管内皮细胞胰岛素信号通路的抑制；高糖培养的内皮细胞功能紊乱与细胞内神经酰胺积聚有关。