脑胶质瘤是最常见的一种原发恶性脑肿瘤,也是目前为止中枢神经系统治疗效果最差的肿瘤之一。脑胶质瘤治疗的最大困难在于复发,这与胶质瘤细胞的无限增殖能力和侵袭性生长有关。脑胶质瘤干细胞仅占胶质瘤细胞成分中的少部分,能自我更新和增殖、分化形成与亲本形态和分子表型相同的肿瘤细胞,连续移植均能形成与亲本相同的肿瘤,是形成不同分化程度胶质瘤细胞的“种子”细胞,在胶质瘤的发生、发展和复发中起决定性作用,因此,本实验选择人脑胶质瘤干细胞作为细胞模型。近年来通过对HH信号通路的深入研究,发现HH信号的异常与人类肿瘤形成有密切的联系。在多种肿瘤中均发现SHH信号通路的异常激活,使用抑制剂阻断SHH信号通路可抑制肿瘤的生长。中枢神经系统中HH信号通路的异常激活可能导致脑肿瘤形成,使用SHH信号通路的特异性抑制剂环杷明(Cyclopamine)能阻止多种原代胶质瘤、髓母细胞瘤及胶质瘤细胞株的生长。HH信号通路在脑肿瘤特别是脑胶质瘤的发生中起重要作用,一些胶质瘤和髓母细胞瘤以及相应的模型系统的维持和存活需要SHH信号通路信号;SHH信号通路可能参与了胶质瘤的启动,而且通常作用于神经前体细胞或有神经干细胞特性的细胞。HH信号通常通过GLI-1发挥作用,GLI-1的表达是细胞对Hh信号传导发生反应的一个可靠标志,其升高水平可能与肿瘤的级别有关。HH信号也可通过细胞周期因子、抗凋亡因子BCL2以及调控或与其他信号通路如Notch通路协同作用等发挥调控作用,影响肿瘤细胞的增殖和存活。鉴于SHH信号通路在NSC或神经前体细胞的自我更新、增殖及分化中起重要作用,而在包括髓母细胞瘤在内的胶质瘤和其它多种肿瘤组织及细胞系中也发现SHH信号通路的异常活化,我们推测在胶质瘤的种子细胞胶质瘤干细胞中应该也有SHH信号的异常变化并可能对胶质瘤的发生、发展起重要作用,但是究竟如何变化?这些变化又是通过何种机制决定胶质瘤干细胞的命运及调控其增殖、分化等生物学行为?目前国内外尚未见报导,值得进一步深入研究。在本课题中,在第一部分实验中采用以CD133为标志的免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,诱导分化后检查分化细胞标志物MAP2、GFAP、MBP以及电镜超微结构观察和移植SCID鼠致瘤实验,对其干细胞特性加以鉴定,得到如下结果:不同病理分级的新鲜胶质瘤标本和胶质瘤细胞株中存在一小部分CD133+的胶质瘤细胞,能表达干细胞的标志物CD133和Nestin,符合干细胞的超微结构特点,体外培养能连续传代;具有多向分化潜能:诱导分化后能产生MAP2、β-TubulinⅢ、GFAP、MBP染色阳性的细胞;移植SCID鼠后能形成与亲本肿瘤表型一致的移植瘤。因此,这一小部分CD133+胶质瘤细胞具有干细胞的属性,就是胶质瘤中的肿瘤干细胞,即胶质瘤干细胞。在第二部分实验中,采用体外分离培养的胶质瘤干细胞作为细胞模型,首先研究胶质瘤干细胞增殖、分化培养过程中SHH信号通路基因和蛋白的表达情况,以及脑胶质瘤组织和细胞株中的蛋白表达情况及细胞类型,并分析与脑胶质瘤干细胞增殖、分化的关系;在此基础上,构建了针对人SHH基因的RNA干扰逆转录病毒载体,应用RNAi技术抑制脑胶质瘤干细胞中SHH信号通路的表达和作用,应用免疫荧光技术、RT-PCR、Western Blot和流式细胞术等检测对体外培养的脑胶质瘤干细胞增殖、分化、存活以及移植SCID鼠后致瘤能力的影响,得到如下结果:1、脑胶质瘤组织和细胞株中有Shh、Gli-1和Bmi-1表达,而正常成人脑组织中则未能检测到;Shh和Gli-1在高级别胶质瘤组织中的表达强于低级别胶质瘤组织中;Bmi-1表达与胶质瘤病理分级无明显关系。2、Shh和Gli-1表达于相对分化而又未完全成熟的MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中,发育较成熟的细胞中表达极弱或检测不到;CD133阳性细胞中未检测到,提示Shh和Gli-1表达可能与胶质瘤细胞分化启动和维持有关,而且没有明显细胞特异性。3、CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中均检测到了Bmi-1,CD133和MAP2阳性细胞表达强于GFAP和MBP阳性细胞;Bmi-1在相对幼稚细胞中表达强于相对成熟细胞,提示Bmi-1强表达可能与胶质瘤细胞未分化或低分化状态维持有关。4、胶质瘤干细胞增殖过程未检测到SHH基因mRNA和蛋白表达,GLI-1基因mRNA和蛋白呈弱表达,而BMI-1基因mRNA和蛋白呈强表达,提示在脑胶质瘤干细胞增殖过程中有极低水平的Gli-1信号维持作用,可能与干细胞状态和细胞存活维持有关。5、胶质瘤干细胞分化时SHH和GLI-1基因mRNA及蛋白表达呈逐渐增强,然后逐渐减弱至消失的过程,CD133表达逐渐减弱,MAP2、GFAP和MBP出现表达并逐渐增强,提示SHH信号通路表达可能参与了胶质瘤干细胞分化启动和阶段性调控作用。6、成功构建了pSiRNA-SHH和pSiRNA-NC,并经PT 67细胞包装后生成了相应的逆转录病毒载体。7、对SHH信号通路进行RNAi后,胶质瘤干细胞增殖受到抑制,存活细胞减少;G0/G1期细胞减少,S期细胞出现耗竭或被阻滞于S期,凋亡/坏死细胞增加,提示SHH信号通路对胶质瘤干细胞增殖、细胞分裂和存活有促进作用,该作用可能是通过调控细胞周期以促进细胞分裂、减少细胞凋亡/坏死实现的。8、对SHH信号通路RNAi后,脑胶质瘤干细胞分化受到抑制,死亡细胞明显增加,培养的第3d干扰组中CD133、β-TubulinⅢ、GFAP和MBP阳性细胞所占比例均明显升高,提示细胞被阻滞于能同时表达上述标志物的特定多能干细胞阶段,说明SHH信号通路促进胶质瘤干细胞分化和存活。9、经RNAi-SHH处理后的胶质瘤干细胞移植SCID鼠后8周未见肿瘤形成,而未经处理的同种细胞在低2个数量级情况下移植也导致肿瘤形成,提示RNAi-SHH对脑胶质瘤干细胞移植后致瘤能力产生抑制,但有待更多数量动物原位实验加以验证。总之,通过本课题的研究,结果表明:SHH信号通路的基因和蛋白在脑胶质瘤的增殖、分化和存活的过程中同样表达并发挥重要的调控作用,不仅促进脑胶质瘤干细胞的增殖和存活,同样也促进并调控脑胶质瘤干细胞的分化过程和存活,该作用可能是通过调控细胞周期以促进细胞分裂、减少细胞凋亡/坏死实现的。同时应看到,SHH信号仅仅是胶质瘤增殖、分化和存活中起关键作用的信号通路之一,其他的信号通路如Notch、WNT、EGF、bFGF信号通路可能也对胶质瘤增殖、分化和存活起着重要作用,因此,很可能是众多信号通路协同作用,共同完成对胶质瘤干细胞增殖分化和存活的综合调控作用。对这些关键因素的进一步研究,将在更广更高的层面上加深我们对调控胶质瘤发生、发展和复发机制的认识和理解。