福氏志贺菌酸性磷酸酶在合成稀有己酮糖中的应用

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稀有己酮糖因具有抗肿瘤、抗炎、抗高血糖和免疫抑制作用等生理功能,在食品和制药行业中有广泛的应用前景。因此,建立一个高效、低廉的稀有己酮糖合成体系具有重要的意义。本论文将福氏志贺菌(Shigella flexneri)来源的酸性磷酸酶PhoN-Sf应用于稀有己酮糖合成体系,为稀有己酮糖的工业化生产提供理论依据。本论文的目的是建立以甘油为唯一碳源,通过多酶级联反应合成一系列稀有己酮糖的方法。磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶能够催化供体底物DHAP和受体底物D-/L-甘油醛(D-/L-GA)合成己酮糖-1-磷酸。首先,为了避免直接使用昂贵并且不稳定的DHAP,将酸性磷酸酶(PhoN-Sf)、甘油磷酸氧化酶(GPO)引入级联反应体系,以甘油为底物合成DHAP,分别利用三种DHAP依赖型醛缩酶:L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)、L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(Fuc A)和D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FruA)催化DHAP和外加的D-/L-GA合成相应的己酮糖-1-磷酸,同时PhoN-Sf催化己酮糖-1-磷酸脱磷酸得到稀有己酮糖。其次,为解决外加甘油醛问题,分别将醛醇氧化酶(AldO)和马肝醇脱氢酶(HLADH)引入级联反应,建立了以甘油为唯一碳源合成稀有己酮糖的多酶级联反应体系。再次,为了避免复杂的酶纯化工艺,将相关酶类在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,建立全细胞多酶催化体系。最后,为了建立安全的全细胞催化体系,将相关酶类在ClearColi?BL21中过量表达,建立“无内毒素”的大肠杆菌稀有己酮糖合成平台。本论文主要研究成果如下:(1)、以甘油为底物”一釜多酶法”合成稀有己酮糖:利用AldO能特异性地将甘油氧化生成D-GA的性质,将PhoN-Sf、GPO、Ald O分别与三种醛缩酶偶联,以甘油为底物合成D型稀有己酮糖。醛缩酶为RhaD时,合成D-阿洛酮糖和D-山梨糖的浓度分别为9.61 g?L-1和4.57 g?L-1;醛缩酶为FucA时,合成D-阿洛酮糖和D-山梨糖的浓度分别为1.44 g?L-1和8.66 g?L-1。利用HLADH和NADH氧化酶(NOX)能够将甘油氧化生成L-GA的性质,将PhoN-Sf、GPO、HLADH、NOX分别与三种醛缩酶偶联,以甘油为底物合成L型稀有己酮糖。醛缩酶为RhaD时,合成L-果糖的浓度为10.70 g?L-1;醛缩酶为FucA时,合成L-塔格糖和L-果糖的浓度分别为3.11 g?L-1和5.0 g?L-1;醛缩酶为FruA时,合成L-山梨糖的浓度为9.64 g?L-1。(2)、以甘油为底物全细胞多酶级联体系合成稀有己酮糖:将PhoN-Sf、AldO、GPO以及醛缩酶在BL21(DE3)中过量表达。当醛缩酶为RhaD时,生成D-阿洛酮糖和D-山梨糖的浓度分别为6.2 g?L-1和3.1 g?L-1;当醛缩酶为FucA时,生成D-阿洛酮糖和D-山梨糖的总浓度为3.51 g?L-1和0.5 g?L-1。为了构建安全高效的稀有己酮糖全细胞合成平台,将PhoN-Sf、GPO、RhaD以及AldO在ClearColi?BL21(DE3)中过量表达,在最优条件下,生成D-阿洛酮糖和D-山梨糖的总浓度为3.67 g?L-1和1.83 g?L-1
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