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目的:胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,占颅脑原发性肿瘤的40%~50%,年发病率为3~8人/10万人。2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类重新构建胶质瘤的分型,将分子表型整合组织病理作为诊断标准。这是首次将分子变异纳入诊断金标准,也是癌症领域的一次变革。多形性胶质母细胞瘤((Glioblastomas,GBM))发病率最高,约占星形细胞瘤的75%。其生长速度快,70%~80%未治疗患者病程在3~6个月,病程超过1年者仅10%。当前针对胶质母细胞瘤所采取的疗法,主要包括手术、化疗以及放疗等在内的综合性治疗。但由于肿瘤细胞的高增殖性、高侵袭性,丰富的肿瘤新生血管,导致肿瘤全切困难,易复发,易脑内侵袭和脑脊液播散;同时由于大脑血脑屏障和肿瘤干细胞等因素的存在,肿瘤具备耐放疗和抗化疗的特征,导致GBM患者中位生存期仍只有12-15个月,5年生存期在10%以下。近年来胶质瘤治疗的研究领域有了一些新的发展与突破,包括当前应用最为广泛的分子靶向治疗和正在开展临床试验的免疫治疗、电场疗法(Tumor Treating Fields,TTF)等。其中免疫治疗主要关注于在机体内通过体液免疫和细胞免疫抑制肿瘤细胞的生长;TTF是近年来新兴的胶质瘤治疗手段。由于胶质瘤特殊的肿瘤异质性,分子多靶点的靶向治疗是目前胶质瘤治疗研究的重要方向。研究表明,胶质瘤特别是胶质母细胞瘤对常规治疗方法的耐受性主要是由于高度突变的基因组导致的显著肿瘤异质性。这涉及激活一系列相关信号通路及受体,如酪氨酸激酶受体(TKR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、有丝分裂原活化蛋白激酶通道(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶标(MTOR)信号通路等。众所周知,这些信号通路上相关的关键基因调节细胞增殖、血管生成、迁移和侵袭,以及凋亡和自噬,因此,这些信号通路的失调会导致肿瘤的形成、进展、侵袭和对各种治疗方法的耐药性。目前对于这些相关基因变异、信号传导通道的基础研究取得了许多成果并应用于临床,但效果有限。上皮内膜蛋白1基因位于第12染色体p12.3位点,其编码产物上皮内膜蛋白1(Epithelial membrane protein-1,EMP1)对于增加G1期以及缩减S期有着特殊的影响,而且参与具体的肿瘤形成、肿瘤增殖以及分化等多个方面,构成了较为特殊的传导通路。EMP1与一系列生物学活动有关,包括细胞侵袭、增殖、分化和凋亡。多个肿瘤研究中均发现EMP1与肿瘤细胞的侵袭及迁移能力有关。EMP1在不同类型肿瘤中的表达水平有所不同,在部分肿瘤中高表达,而在另一些肿瘤中低表达,对肿瘤的影响也各不相同;在一些实体肿瘤的研究中发现EMP1可以影响PI3K/AKT信号通道。目前EMP1在胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的作用及其相关信号通道及机制尚无深入研究。本研究旨在探讨EMP1在胶质瘤中的表达水平及其对预后的影响,使用小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)下调肿瘤细胞/干细胞中EMP1的表达后对胶质瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其信号传导机制。探索EMP1能否作为胶质瘤分子靶向治疗的潜在靶点。方法:利用癌症基因组图谱(TCGA和CCGA)中的神经胶质瘤细胞及正常脑组织资料,使用GEPIA生物信息学方法分析信息库内胶质母细胞瘤及低级别胶质瘤中EMP1表达水平并与正常脑组织比较。使用RT-qPCR方法检测胶质瘤与正常脑组织样本中EMP1mRNA的水平,Western-blot法检测肿瘤及正常脑组织样本中EMP1蛋白表达的水平,对比胶质瘤与正常脑组织中EMP1表达的差异。设计针对EMP1的siRNA,转染U251和U87胶质瘤细胞,Western-blot法及免疫荧光方法检测转染后细胞内EMP1蛋白表达水平并比较未转染肿瘤细胞中EMP1水平的差异。使用CCK-8方法检测siRNA转染U251和U87胶质瘤细胞的增殖能力,Transwell方法检测转染后肿瘤细胞的侵袭能力,Western-blot法检测转染后肿瘤细胞中CD44和MMP2蛋白表达水平并与未转染肿瘤细胞比较。使用Annexin-V FITC/PI双染法检测siRNA转染U251和U87胶质瘤细胞后肿瘤细胞凋亡能力的变化,与未转染肿瘤细胞比较。构建U87细胞裸鼠荷瘤模型,免疫组化及免疫荧光方法检测荷瘤小鼠肿瘤中Ki-67、MMP2的表达并与对照组比较。Western-blot法、免疫荧光方法检测siRNA转染后U251和U87胶质瘤细胞中PI3K、AKT的磷酸化水平及其下游产物Bcl2和Caspase-3的表达,并与未转染肿瘤细胞比较。胶质瘤细胞系U251培养U251s细胞,Western-blot法及免疫荧光方法检测siRNA转染U251s细胞后干细胞EMP1、CD44蛋白及其相关干细胞表面标志物Nestin、OCT4、SOX2和Nanog的表达水平。结果:GBM和低级别胶质瘤中EMP1表达均高于正常脑组织。GBM中EMP1的mRNA水平与蛋白水平明显高于正常脑组织。胶质瘤中EMP1高表达肿瘤其中位生存时间和中位无病生存时间均明显低于EMP1低表达肿瘤。使用针对EMP1的siRNA朱转染U251和U87细胞系胶质瘤细胞可以显著减低细胞中EMP1蛋白及mRNA的表达。siRNA转染后U251和U87细胞系胶质瘤细胞后EMP1沉默,细胞增殖率显著降低,胶质瘤细胞的侵袭能力下降。EMP1沉默还可以降低侵袭相关蛋白CD44和MMP2蛋白的表达。同时,转染后胶质瘤细胞的凋亡能力明显加强。荷瘤小鼠模型中U87-Si-EMP1组肿瘤边界明显,肿瘤体积明显较小;U87-Si-EMP1组中Ki-67和MMP2的表达明显降低。U251和U87细胞系胶质瘤细胞中EMP1沉默降低了 PI3K和AKT的磷酸化,在PI3K-AKT信号传导途径的下游,细胞中Bcl2表达下降和Caspase-3表达升高。siRNA转染U251s细胞后EMP1蛋白水平下降,降低CD44的表达,同时也抑制了干细胞细胞表面标志物Nestin,SOX2,OCT4和Nanog的表达。结论:本研究中,利用TCGA和CGGA数据,结合生物信息学分析,我们发现胶质瘤组织中EMP1表达水平相对较高,并且高水平的EMP1表达提示胶质瘤患者的预后不良。对于胶质瘤样本的检测也证实胶质瘤组织中EMP1表达水平相对较高。使用针对EMP1的siRNA能可靠的降低细胞中EMP1的水平,抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭,降低细胞中侵袭相关蛋白CD44和MMP2的水平,加强肿瘤细胞的凋亡能力。荷瘤模型的实验结果表明,下调EMP1组肿瘤的Ki67与MMP2表达均明显下降。提示肿瘤的增殖与侵袭能力下降。研究结果提示EMP1调节肿瘤细胞的增殖和侵袭可能是通过PI3K/AKT信号传导途径实现。肿瘤干细胞中EMP1的沉默降低了 CD44及相关干细胞表面标志物Nestin,SOX2,OCT4和Nanog的表达。我们认为CD44可能是EMP1信号通路中的关键介质,这些结果提供了胶质瘤治疗和预后评估的新策略。