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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是最常见的神经系统变性疾病之一,炎症是引起其病理机制级联反应最终导致多巴胺（Dopaminergic,DA）神经元变性缺失的重要因素[1-3]。目前常用的DA替代治疗只能缓解症状,无法治愈,针对其病理机制进行疾病修饰治疗是临床亟需解决的关键问题[4-6]。辅助性T细胞17（T helper 17 cells,Th17）是近年来免疫学研究的热点之一,其分化与调节的异常与自身免疫性疾病密切相关[7-10]。研究显示,Th17细胞在PD患者和动物模型中都具有重要的作用,调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）可缓解Th17细胞导致的DA神经元变性[3,11-16]。PD患者早期外周循环中即出现Th17细胞比例增高,提示Th17细胞导致的神经炎症在PD发病中具有重要的作用[17-21]。PD患者外周Treg细胞功能受损,与疾病的严重程度相关[22]。在PD患者及其动物模型的研究中,血脑屏障均存在一定程度的破坏,外周淋巴细胞可向脑部迁移浸润,通过CD4+T细胞依赖的Fas/Fasl途径介导DA神经元的损伤[12-14,23,24]。向PD模型小鼠外周过继转移Clopoymer-1刺激的免疫细胞,可抑制小胶质细胞激活,保护DA神经元[25]。在PD患者脑组织及其动物模型中,外周Th17细胞加重了 DA神经元的损伤变性,过继转移Treg细胞或阻断白介素-17（interleukin-17,IL-17）受体信号通路可缓解其神经毒性作用[11-16]。Th17细胞是一种新型的辅助型CD4+T细胞,主要分泌IL-17产生致病作用[8,9]。CD4+T 细胞可在白介素-6（interleukin-6,IL-6）和转化生长因子β（transforming growth factor β,TGF-β）的共同作用下,促进维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid related orphan nuclear receptor yt,RORγt）的表达诱导 Th 17 细胞分化,在白介素-23（interleukin-23,IL-23）的作用下维持其分化与成熟[8-10]。高浓度TGF-β则可诱导叉头框蛋白p3（forkhead box protein p3,Foxp3）的表达促进Treg细胞分化,维持体内的免疫平衡[8]。目前已有多种细胞因子的靶向策略抑制Th17细胞分化或阻断IL-17受体信号通路,成为自身免疫性疾病的潜在治疗靶点[7,11,12,14,21]。因此,Th17细胞的发现不仅为研究PD炎症机制提供了新的视角,更为其疾病修饰治疗提供了新的靶点。脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs）具有独特的免疫调节功能和低免疫原性,已应用于临床多种疾病的治疗研究[26,27]。课题组的前期研究也显示AD-MSCs可抑制多发性硬化患者外周Th17细胞分化,减少IL-17A的分泌[28]。虽然已往研究提示Th17和Treg细胞失衡与PD的发病存在相关,但AD-MSCs能否抑制PD外周Th17细胞分化,进而作为调控免疫平衡延缓PD疾病进展的策略至今尚缺乏相关研究,这对于临床发展疾病修饰治疗具有重要意义。综上研究进展及课题组前期工作基础,本研究提出的科学假说是:AD-MSCs通过调控PD外周Th17/Treg平衡,缓解其运动症状和病理损害。在前期研究的基础上,本研究的第一部分分析了 PD患者外周Th17和Treg细胞比例及其特异性核转录因子和效应细胞因子的变化。结果显示,PD患者外周血液中Th17细胞激活,IL-17A分泌增多;Treg细胞比例降低,Foxp3表达下调,效应细胞因子IL-10和TGF-β的分泌减少;提示PD患者外周可能存在Th17/Treg免疫功能的失衡。为分析AD-MSCs是否具有调控PD患者外周Th17/Treg平衡的作用,第二部分研究构建了 PD患者外周血Th17和Treg细胞极化状态下的AD-MSCs共培养体系;通过体外实验确定了 AD-MSCs可抑制Th17细胞分化及其核转录因子RORyt的表达,提高Treg细胞比例及其效应细胞因子IL-10的分泌,调控Th17/Treg平衡。在上述研究结果基础上,第三部分研究应用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导 C57BL/6 小鼠建立 PD 模型,进一步通过体内实验证实了 AD-MSCs可调控MPTP小鼠外周Th17/Treg平衡,并改善其行为学及病理损害。结果显示,MPTP诱导的PD模型小鼠脾脏中Th17细胞激活,Treg细胞数量减少功能受损;MPTP小鼠行走总路程、平均速度和静止时间等行为学指标均明显受损,黑质炎症因子表达增加,TH+神经元数量减少。经AD-MSCs尾静脉注射治疗后,上述指标均得到明显改善。提示AD-MSCs可调控PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡并缓解其病理损害,为PD疾病修饰治疗提供了新的思路。IL-6是调控Th17/Treg平衡的关键细胞因子,白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）与IL-6结构相似,但功能相反,可调控Foxp3和RORγt的表达进而调节Th17和Treg细胞的分化[28,29]。本研究第四部分工作聚焦于LIF/IL-6/Foxp3/RORγt信号通路进行相关实验,进一步探讨AD-MSCs调控PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡的作用机制。AD-MSCs尾静脉注射治疗后,MPTP小鼠脾脏中Th17细胞比例降低,其特异性核转录因子RORγt及效应细胞因子IL-17A的表达减少;Treg细胞比例增高,核转录因子Foxp3和效应细胞因子TGF-β的表达相应上调。AD-MSCs治疗组小鼠脾脏中,LIF 和 LIF 受体（LIF receptor,LIFR）的表达增多,IL-6 和 IL-6 受体（IL-6 receptor,IL-6R）的表达减少。上述研究结果提示,AD-MSCs可调控MPTP诱导的PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡,其机制可能与LIF/IL-6/Foxp3/RORγt信号通路相关。第一部分 PD患者外周Th1 7/Treg失衡的研究目的:研究PD患者外周血Th17和Treg细胞数量和功能的变化。方法:比较PD患者和健康对照组外周CD4+T细胞中Th 17和Treg细胞比例,及其分化调节过程中关键核转录因子和细胞因子的变化,分析PD患者外周免疫是否存在Th17/Treg细胞失衡。采用流式细胞术检测Th17和Treg细胞占CD4+T细胞的比例,Real-time PCR检测核转录因子RORγt和Foxp3的表达,ELISA法检测Th17和Treg细胞分化过程中的关键细胞因子IL-17A、IL-10和TGF-β的分泌。结果:PD患者组与健康对照组相比,Th17细胞比例增高,IL-17A的分泌增多;Treg细胞比例降低,Foxp3的表达减少,IL-10和TGF-β的分泌减少;Th17与Treg的数量比值,IL-17A与IL-10和TGF-β分泌量的比值均明显增高。两组间比较,差异有统计学意义（p＜0.05）,提示PD患者外周可能存在Th17和Treg细胞数量和功能上的失衡。结论:PD患者外周血液中Th17细胞激活,IL-17分泌增多;Treg细胞比例降低,功能受损;PD患者外周可能存在Th17/Treg失衡。第二部分 AD-MSCs体外调控PD患者外周Th17/Treg平衡的作用目的:体外研究确定AD-MSCs调控PD患者外周血液中Th17/Treg平衡的作用。方法:构建PD患者外周血Th1 7和Treg细胞极化条件下的AD-MSCs共培养体系,通过体外实验分析AD-MSCs是否具有调控PD患者外周Th17/Treg平衡的作用。采集6例PD患者外周静脉血,采用密度梯度离心法分离单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,使用磁珠分选CD4+T细胞,分别构建Th17和Treg细胞极化条件下的AD-MSCs（AD-MSCs:CD4+T为1:4）共培养体系。共培养4天后,采用流式细胞术检测 IL-17+CD4+T cells（Th17）和 CD4+CD25+Foxp3+T（Treg）占 CD4+T细胞数量的比例,ELISA法检测共培养体系上清液中IL-6、IL-23、IL-10、TGF-β和LIF 的分泌,Real-time PCR 检测 RORγt、IL-6R、IL-23R 和 LIFR mRNA 的表达。结果:通过磁珠分选PD患者PBMC,分离出的CD4+T细胞分别在Th17和Treg细胞极化条件下与AD-MSCs共培养。AD-MSCs共培养组与加入PBS的对照组比较结果显示:Th17极化条件下,Th17细胞比例降低,RORγt和IL-23R的表达减少;Treg极化条件下,Treg细胞比例增高,IL-10的分泌增多。在Th17和Treg极化条件下,AD-MSCs共培养组中IL-6R的表达均减少,LIF及其受体LIFR的表达均增多,LIF的分泌也明显增多。提示AD-MSCs可能抑制PD患者外周Th17细胞的分化及其特异性核转录因子的表达,促进Treg细胞的生成和IL-10的分泌,从而调控Th17/Treg平衡。结论:AD-MSCs可抑制PD患者外周Th17细胞的分化,促进Treg细胞的生成和IL-10的分泌。第三部分 PD模型小鼠外周Th17/Treg失衡以及AD-MSCs静脉注射的治疗作用目的:研究PD模型小鼠外周Th17/Treg失衡,探讨AD-MSCs尾静脉注射治疗PD模型小鼠的效果及潜在机制。方法:选取清洁饲养10-12周龄C57BL/6雄性小鼠（25-30g）,腹腔注射MPTP构建PD模型,注射剂量为18 mg/kg/次,每间隔2 h注射1次,共4次;腹腔注射等量生理盐水作为正常对照组。C57BL/6小鼠在MPTP末次注射后12小时,经尾静脉注射AD-MSCs（1.0×106/ml）200μ1。AD-MSCs静脉注射第7天,行旷场实验观察MPTP小鼠行为学指标变化,免疫荧光组织化学染色法分析AD-MSCs尾静脉注射治疗组以及MPTP小鼠组黑质TH+神经元的数量变化。采用流式细胞术检测MPTP小鼠和正常对照组脾脏中Th17和Treg细胞比例,Real-time PCR检测小鼠脾脏以及黑质中RORγt、Foxp3、IL-17A和TGF-β等炎症因子的表达。结果:在MPTP诱导的PD模型小鼠脾脏中,Th17细胞比例增高,RORyt和IL-17A的表达增多;Treg细胞比例降低,Foxp3和TGF-β的表达减少;Th17与Treg的比值,RORyt和Foxp3的比值,IL-17A与TGF-β的比值也明显增高。MPTP小鼠组行走总路程、平均速度和静止时间等行为学指标均受损,中脑黑质TH+神经元的数量也明显减少;黑质中Th17相关细胞因子IL-6、IL-23、IL-17A和RORγt的表达增多,Treg相关细胞因子TGF-β和Foxp3的表达减少。经AD-MSCs尾静脉注射治疗后,MPTP小鼠上述指标均明显改善。上述结果提示,PD模型小鼠外周存在Th17/Treg失衡,AD-MSCs尾静脉注射治疗可调控Th17/Treg平衡,缓解MPTP小鼠运动症状和黑质DA神经元变性。结论:MPTP诱导的PD模型小鼠外周存在Th17/Treg失衡,AD-MSCs尾静脉注射治疗可改善PD模型小鼠的运动症状,缓解黑质炎症和病理损害。第四部分 AD-MSCs调控PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡机制的研究目的:研究AD-MSCs调控MPTP诱导的PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡的可能作用机制。方法:初步探讨AD-MSCs调控PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡的作用机制,聚焦于LIF/IL-6/Foxp3/RORγt信号通路开展相关实验。采用流式细胞术检测AD-MSCs治疗组,PD模型组和正常对照组小鼠脾脏中Th17和Treg细胞比例;Real-time PCR检测脾脏中核转录因子RORγt和Foxp3,分化过程中的关键细胞因子LIF、IL-6、IL-23、IL-17A、TGF-β以及相关受体 LIFR（gp190）、IL-6R（IL-6Rα）和 IL-23R 的表达。Western Blot实验分析PD模型小鼠脾脏中磷酸化信号转导蛋白和转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription three,STAT3）蛋白表达的变化。结果:AD-MSCs尾静脉注射治疗后,PD模型小鼠脾脏中Th17细胞比例降低,RORγt、IL-17A、IL-23 和 IL-23R 的表达下调;Treg 细胞比例升高,Foxp3 和 TGF-β的表达上调;Th17与Treg的数量比值,RORγt与Foxp3以及IL-17A与TGF-β的表达比值均明显降低;提示AD-MSCs可调控PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡。AD-MSCs尾静脉注射治疗组小鼠脾脏中,LIF和LIFR的表达增多,IL-6和IL6-R的表达减少,磷酸化STAT3蛋白的表达也相应降低。LIFR和IL-6R具有共同的受体亚基gp130,LIF和IL-6可通过受体竞争性抑制机制形成LIF/IL-6轴调控RORγt/Foxp3的表达[29]。上述结果提示AD-MSCs调控PD外周Th17/Treg平衡的作用机制可能与LIF/IL-6/Foxp3/RORγt 信号通路相关。结论:AD-MSCs尾静脉注射治疗可调控MPTP诱导的PD模型小鼠外周Th17/Treg平衡,其机制可能与LIF/IL-6/Foxp3/RORγt信号通路相关。综上所述,本研究工作的创新之处主要在于:1.发现Th17/Treg失衡与PD发生的相关性 研究发现PD患者和MPTP诱导的PD模型小鼠均存在外周Th17/Treg细胞数量的失衡,并通过其效应细胞因子IL-17A和TGF-β的进一步检测分析,确定了 Th17/Treg平衡功能的受损。2.确定AD-MSCs调控外周Th17/Treg平衡对PD的治疗作用 研究通过PD患者外周血的细胞实验以及PD模型小鼠的体内实验两个层面,从细胞、分子以及动物行为学和神经病理等多个方面阐述了 AD-MSCs调控外周Th17/Treg平衡对PD的治疗作用。上述结果是对目前缺少AD-MSCs调控Th17/Treg平衡治疗PD相关研究现状的有效补充。3.发现AD-MSCs调控PD外周Th17/Treg平衡的可能机制 研究进一步发现,AD-MSCs调控PD外周Th17/Treg平衡的作用机制可能与LIF/IL-6/Foxp3/RORγt信号通路相关,为临床应用AD-MSCs免疫调控治疗PD提供了部分实验依据。