阿维菌素工业生产菌的诱变筛选及工艺条件优化

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阿维菌素是由阿维链霉菌发酵而来的次级代谢产物,它因对线虫、螨虫等一些害虫具有高效的致死作用,但对哺乳动物没有毒性被大众广泛认可。它也因其自身具有可见光降解的特点,被贴上环保的标签,使其与传统类农药形成一定的优势。随着市场上需求使用量越来越大,需要不断扩大生产。而阿维菌素在生产上存在着菌株退化,产量不高,生产成本大等问题。且随着农药领域上的广泛应用,阿维菌素药物的抗性问题也被高度关注。为了解决上述问题,本论文利用不同方法对工业上使用的菌株进行菌种选育,对培养基与发酵工艺条件、检测浸提条件进行优化,采用分子模拟对阿维菌素与谷氨酸氯离子通道进行作用机制的研究,主要研究结果如下:1)经过对不同菌落形态的效价检测,得到效价筛选结果较高的菌落表型。再根据菌落形态对紫外线照射诱变、亚硝基胍诱变、以及紫外线-氯化锂复合诱变的单菌落进行随机筛选。经过初筛得到12株效价较高的单菌落,再对初筛得到的单菌落进行摇瓶复筛,得到一株效价为9060μg/m L的菌株,比出发菌株效价高27.6%。2)以玉米淀粉、糊精、葡糖糖、水溶性淀粉分别作为阿维菌素发酵培养基主要碳源,每24 h检测发酵过程当中溶磷、菌浓、总糖以及效价的变化,最终得出发酵最佳碳源为糊精。其中以葡萄糖作为阿维菌素发酵培养基主要碳源时,发酵效果最不理想,以黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、小麦胚芽粉作为阿维菌素发酵培养基主要氮源,每24 h检测发酵过程当中溶磷、菌浓、总糖以及效价的变化,得到发酵最佳氮源为黄豆饼粉。通过对不同微量元素浓度的优化,氯化钴的最佳添加量为0.02 g/L,硫酸锰的最佳添加量为0.0023 g/L,钼酸钠的最佳添加量为0.02 g/L,硫酸铵的最佳添加量为0.25 g/L。3)通过单因素试验与正交实验得到最佳种龄、装液系数、摇床转速、接种量、p H、温度、超声时间、以及浸提次数分别为44 h、40 m L、220 r/min、5%、7.5、28.5℃、20 min、2次。4)将阿维菌素与谷氨酸氯离子通道蛋白进行分子对接,结合能结果为-8.8kcal/mol,意味着Avermectin_B1a对谷氨酸氯离子通道具备潜在活性效果。且Avermectin_B1a结合在谷氨酸氯离子通道当中,分析得到与多聚体当中THR-251形成两个氢键作用,此外还与离子通道上的LEU-254、ALA-258、ALA-261重复性地形成疏水接触作用。分析THR-251、LEU-254、ALA-258、ALA-261残基可能为Avermectin_B1a与谷氨酸氯离子通道蛋白的关键性氨基酸。同时进行分子模拟,在8ns时间内配体与蛋白的RMSD均较为稳定,为后续阿维菌素农药的抗性研究提供潜在意义。
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