降钙素基因相关肽(CGRP)是一种在骨组织中广泛分布的神经肽,已发现,CGRP与骨组织的增殖、塑形密切相关。通过组织学研究,在骨折愈合试验中观察到,骨组织中,含CGRP的神经纤维主要分布在骨生成和塑形活跃的区域,例如在长骨的干骺端分布就比骨干部位高约10倍,且神经分布及CGRP含量的变化与骨折痊愈的过程紧密相关。研究证实,CGRP能显著促进成骨细胞增殖,增强成骨活性。骨髓间充质干细胞(MSCs)是成骨细胞重要的来源干细胞,也是骨组织工程的主要种子细胞来源。MSCs的增值能力,直接影响骨的生长、塑形和修复,也对组织工程骨的构建效能和成骨能力起着决定性的作用。因此,对影响MSCs增殖的因素的研究,一直是骨科界和组织工程学界研究的重点。目前的研究已经发现,MSCs在骨组织的分布,主要集中在干骺端的红骨髓中,这与CGRP能的神经分布相符合,相关研究也发现,CGRP能促进骨髓有核细胞集落的形成。但是关于CGRP对MSCs的增殖的影响及其机制,仍有大量研究需要深入。第一部分人骨髓间充质干细胞表面CGRP受体存在证据目的:寻找人骨髓MSCs表面存在CGRP受体的确切证据(从基因及蛋白质表达水平)方法:原材料采自健康志愿者骨髓,应用梯度离心法及贴壁培养筛选,获得MSCs细胞。体外培养扩增后,取对数生长期细胞,采用RT-PCR技术进行细胞CGRP受体mRNA表达检测;采用杂交瘤技术,获得兔抗人CGRP受体蛋白抗体,利用该抗体,使用Westernblot技术进行MSCs表达CGRP受体蛋白检测。结果:采用梯度离心及贴壁培养筛选,细胞纯度较高,表面标记稳定,且与文献报道相符;经RT-PCR检测结果,证实人骨髓MSCs表达CGRP受体mRNA;采用杂交瘤技术获得的兔抗人CGRP受体抗体,结构稳定,滴度较高,能较好的满足Westernblot试验需要;采用Westernblot的DAB显色法,检测出人MSCs表达CGRP受体蛋白,且表达量较大。结论:采用梯度离心及贴壁培养法获得MSCs纯度较高,增殖效果稳定;经过RT-PCR检测,证实MSCs表达CGRP受体mRNA;Western-blot检测证实,MSCs表达CGRP受体蛋白。第二部分CGRP对人骨髓间充质干细胞增殖的作用目的:观察在添加外源性CGRP的情况下,MSCs增殖的改变,并证实这种改变与添加CGRP间的关联性方法:MSCs获取仍采自健康志愿者骨髓,应用梯度离心法及贴壁培养筛选,获得MSCs细胞。分组采用对照组、CGRP组(根据CGRP添加的终浓度分为10-7mol/ L、10-8mol/ L和10-9mol/ L三组),以MTT法检测细胞增殖曲线变化;体外培养扩增后,取相同时相点,光镜下进行细胞形态观察;将各组细胞在第三代传代后72小时的对数生长期,进行细胞周期检测,观察各组细胞处在DNA合成期及细胞分裂前期的比例。结果:经过对照培养,细胞增殖同时相点,对照组细胞细胞密度低于各实验组,细胞形态各组均较为典型、规则;细胞周期检测,各实验组处于细胞分裂前期及DNA合成期细胞比例明显高于对照组,各实验组间该比例为,10-8mol/ L>10-9mol/ L组>10-7mol/ L,但各实验组间差异无统计学意义;MTT组检测,在对数生长期,各实验组增殖速率高于对照组,实验组间细胞增殖速率为10-8mol/ L>10-9mol/ L组>10-7mol/ L。10-8mol/ L速率与另外两实验组间差异有统计学意义,其余两组间无显著性差异结论:采用MTT法,证实添加外源性CGRP能促进对数增殖期MSCs细胞增殖速度;采用流失细胞法检测,证实,外源性CGRP能提高MSCs细胞处于DNA合成和有丝分裂前期的比例。第三部分: CGRP对人骨髓间充质干细胞细胞信号传导的变化的影响的研究目的:观察在添加外源性CGRP的情况下,MSCs胞间通讯连接的改变,并验证改变与CGRP的关联性方法:MSCs获取仍采自健康志愿者骨髓,应用梯度离心法及贴壁培养筛选,获得MSCs细胞。分组采用对照组、CGRP组和拮抗剂组,放射免疫法检测各组胞间信号分子cAMP含量改变;使用CFDA染料,应用激光共聚焦技术观察细胞间缝隙连接和胞间信号传导能力变化;采用荧光定量PCR技术检测缝隙连接分子Cx43mRNA表达变化。结果:放免法检测结果显示,各组间,以CGRP组胞间cAMP含量最高,与其余两组间存在统计学差异;CGRP结合拮抗剂组的含量高于对照组,后两者间无统计学差异。采用激光共聚焦技术,结合CFDA生物活性染料,显示CGRP组荧光信号恢复幅度较对照组及拮抗剂组大,差异有显著性(P<0.05);拮抗剂组恢复幅度较对照组大,但两组间差异不具有显著性(P>0.05)。三组细胞Cx43mRNA表达,CGRP组表达量高于抑制剂组及对照组,差异有显著性(P<0.05);抑制剂组表达量高于对照组,两者间差异无显著性。结论:CGRP能促进MSCs胞间缝隙连接,促进缝隙连接蛋白的基因表达。第四部分:CGRP对人骨髓间充质干细胞细胞增殖相关因子的作用目的:研究在添加外源性CGRP的情况下,与MSCs增殖及分化相关的细胞因子IGF-1、BMP-2的受体mRNA表达变化;研究外源性CGRP是否造成MSCs对成骨诱导因子BMP-2的mRNA表达。方法:MSCs获取、分离及培养方法同前。实验分组为对照组、CGRP组和拮抗剂组,采用荧光定量PCR技术分别检测增殖相关因子IGF-1及其受体mRNA表达;以及成骨分化因子BMP-2及其受体mRNA表达。结果:采用相对定量技术,CGRP组MSCs表达IGF-1、IGF-1受体以及BMP-2受体mRNA量高于拮抗剂组及对照组,且差异有统计学意义。而三组在表达BMP-2 mRNA无显著差异,且Ct值≥35。结论:外源性CGRP能够提高MSCs表达IGF-1、IGF-1受体以及BMP-2受体mRNA,而不能诱导MSCs表达BMP-2mRNA。三组BMP-2的mRNA平均Ct值均在35左右,可以认为阴性表达。