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白血病是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。目前,化疗仍是治疗白血病的主要手段。近20余年来,随着抗癌新药的发现、支持疗法的改善、造血干细胞移植的开展等,白血病的疗效有了一定的提高。但是,多数白血病病人的治疗仍以失败而告终。对化疗药物产生多药耐药性(MDR)是白血病治疗失败的主要原因。 MDR,也称交叉耐药性,是指肿瘤细胞对某一抗癌药物产生耐药性的同时,对其它结构和功能不同的抗癌药物也产生耐药性。国内外学者对MDR的发生机制进行了多年的研究,发现了不少机制:药物转运蛋白过度表达、细胞解毒功能增强、药物的作用靶点改变、细胞DNA损伤修复能力增强、细胞抗凋亡机制的形成等。 随着研究的不断深入,人们发现MDR发生的机制相当复杂。可以说,在抗癌药物作用于肿瘤细胞、最终导致肿瘤死亡的过程中,每一个环节的改变都可能使抗癌药物的作用效果受到影响,导致耐药性的形成。肿瘤细胞多药耐药性的形成极少由单一机制介导,而往往是多种因素共同作用的结果。另外,目前已知的多药耐药机制还不能完全解释肿瘤的MDR现象,尚存在未知的机制。因此,尚待进一步研究阐明。 识别、分离、鉴定耐药细胞和敏感细胞间差异表达的基因是阐明MDR发生机制的重要手段。抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)是一种研究基因差异表达的新方法,它应用抑制性PCR原理,可选择性地扩增两组组织或细胞样本中差异表达的基因片段,从而使差异表达基因得到有效的分离,具有简便易行、灵敏度高、重复性好等优点。SSH已在肿瘤相关基因的分离和鉴定中取得了成效。 耐药肿瘤细胞株的建立是研究MDR发生机制的重要途径。浙江大学肿瘤研究所建立的两种耐药细胞株K562/DOX和K562/VCR,对多种化疗药都具有不同程度的抗性,是典型的MDR细胞。以往的研究发现,mrl基因和Pgp在这两种细胞中高表达,是这两株细胞产生MDR的主要机制,但P-gp的表达尚不能完全解释其MDR现象。因此,对这两株耐药细胞的进一步研究不仅有助于阐明其MDR发生机制,更重要的是可能为白血病MDR机制的研究提供新线索。 本课题先用SSH技术分离、克隆耐药白血病细胞株(K562/DOX)及敏感细胞株(K562)之间差异表达的基因,然后对克隆到的一些基因作表达和功能方面的进一步研究,以期发现白血病MD K发生的新机制。 第一部分 K562八 和K562细胞间差异表达基因的分离和克隆 浙江大学肿瘤研究所建立的多药耐药白血病细胞株K562/DOX对多种化疗药物具有耐药性,是典型的MDR细胞株。以往的研究标明mdrl基因和P-gp在这株细胞中高表达,是其MDR发生的主要机制,但不是唯一机制。 采用钻H技术,分离K562和K562/DOX细胞间差异表达(K562/DOX细胞高表达)的基因片断,并通过T/A克隆方法将差减杂交产物转化大肠肝菌,共获得了200余个克隆。对其中80个克隆进行扩增,提取质粒鉴定,发现73个克隆有插入片断。通过用K562和K562/DOX细胞的CDNA为探针对这73个克隆进行斑点杂交筛选,证实其中14个克隆在K562/DOX细胞中高表达。对这14个克隆进行DNA序列测定,并通过Iniamet与Genbank的已知基因序列比对,这14个克隆代表了门个己知基因,分别是: l.线粒体基因(Human lrTlll:oc,-.--Mndria gCne,complete po) 2.NADH脱氢酶亚单位 2基因(Human NADH dehydrogenase subunit 2,NDZ) 3.电位依赖性阴离于通道3(VDAC3)基因(Human voltage-dependent aulon channl) 4.S3核糖体蛋白基因(S3 ribosoma pfoteirsS3rp) 5.核糖体蛋白(L7a)基因(Human ibosomal ptein L7a) 6.铜/p超氧化物歧化酶侣OD)基因(Human Cu/Zn s-de dismutase) 7.干扰素诱导基因 l-su(Humanl-su gCne rom interferonlnducible gCne — —ly) 8.血红蛋白 zeta基因(Human he。lobin zeta) 2 9.s期激酶激活剂基因(Human aCivato Ofs…ase inase) 10.白血病相关磷蛋白基因(Human fenk而a-associst6d…os…。以饥*n) (LAPI)(staben)) 11.My023基因 以上基因产物中,除铜/@超氧化物歧化酶(SOD)、线粒体与肿瘤耐药的 关系较明确外,其它基因在肿瘤耐药中的作用目前尚无定论。但分析结果表明, 这些基因可能与肿瘤MDR的发生有一定关系,可能代表了多药耐药的新机制。 这些基因有可能分别在MDR发生过程中的不同环节起作用,比如线粒体为Pgp 提供更多的ATP、Cu/ZnSOD阻止化疗药物对DNA的损伤作用、S3tl)加速损伤 DNA的修复等等,与P-gp一起最终导致了K562/DOX细胞MDR的发生。 第二部分 S3rp、NDZ和My023基因在不同白血病细胞株中表达的研究 在 11?