论文部分内容阅读
EB病毒诱导的分子1配体趋化因子(EBV-induced moleculel ligand chemokine, mELC)属于CC类趋化因子。能趋化DC、T细胞、B细胞、NK细胞及巨噬细胞祖细胞等。mELC通过与其受体CCR7的相互作用，促进DC细胞与T细胞接触并呈递抗原从而激发有效的免疫反应。在基因治疗中，腺病毒是应用最广泛的病毒载体之一，但是腺病毒具有较强的免疫原性，重复治疗往往导致目的基因在体内表达量的下降，最终影响治疗结果。本实验构建了小鼠ELC的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-mELC)，采用PEG修饰的阳离子脂质体(PEG-liposome)联合Ad-mELC治疗小鼠恶性腹水，并对其抗肿瘤机制进行了初步探讨。本实验采用AdEasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pShuttle和骨架质粒pAdEasy-1，经过在细菌BJ5183内同源重组构建重组腺病毒载体pAd-mELC。pAd-mELC在包装细胞293中包装成熟的腺病毒颗粒。通过噬斑筛选和PCR鉴定重组腺病毒为复制缺陷型，未含有复制型腺病毒(Replicaton competent adenovirus, RCA)。然后用RT-PCR和Western blot方法对Ad-mELC的体外表达研究显示，Ad-mELC表达的mELC的趋化活性通过趋化实验进行了验证，表明Ad-mELC表达的蛋白mELC能分泌到细胞外，并对淋巴细胞具有趋化活性，并且该活性可以被相应mELC单克隆抗体阻断。同时合成PEG修饰的缓释脂质体PEG-liposome，测定脂质体的平均粒径为151nm，zeta电位38.6mV，性质比较稳定。并用MTT法分别测定了Ad-mELC和PEG-liposome对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果显示Ad-mELC在感染复数(Multiplicity of infection, MOI)为50—800的范围内对细胞增殖无明显影响(P＞0.1)，而且当PEG-liposome对细胞的作用浓度为25ng/10~3细胞时，对细胞也无明显毒性(P＞0.1)。随后建立小鼠纤维肉瘤MethA腹水模型和肝癌腹水模型，设定荷瘤小鼠的治疗剂量为：Ad-mELC 5×10~8pfu／mouse，PEG 0.1mg/mouse。Ad-mELC联合PEG进行治疗(Ad-mELC／PEG)，并设立相应对照组(PBS, PEG, Ad-null,Ad-null／PEG, Ad-mELC)。治疗方案分为早期治疗(小鼠腹腔接种肿瘤2d后开始治疗)和晚期治疗(小鼠腹腔接种肿瘤5d后开始治疗)两种。观察小鼠生存期，结果显示，早期治疗方案的MethA腹水模型和肝癌腹水模型中，Ad-mELC／PEG组小鼠存活率分别为100％和70％，Ad-mELC组小鼠40d存活率分别为70％和50％，其他对照组在腹腔接种肿瘤后10天相继死亡。在晚期治疗方案中，MethA腹水模型的PBS组小鼠平均生存期为11.2d，Ad-mELC治疗组平均生存期为24d。Ad-mELC／PEG治疗组小鼠生存期为31.2d，比对照PBS组平均延长了20d，比单纯Ad-mELC治疗组延长7.2d；在肝癌腹水模型中，PBS对照组小鼠平均生存期为14d，Ad-mELC治疗组平均生存期为21.6d。Ad-mELC／PEG治疗组小鼠生存期为28d，比PBS对照组平均延长了14d，比Ad-mELC治疗组延长6.4d。当小鼠腹腔接种肿瘤第15d后，(即第2次治疗结束后3d)，解剖小鼠并收集腹水，计量腹水体积、肿瘤细胞数和红细胞数。MethA腹水模型中，Ad-mELC／PEG治疗组和单纯Ad-mELC治疗组的平均腹水体积为3.2ml和3.3ml，没有明显差异(P＞0.1)，但与PBS对照组(18.2ml)相比，统计学差异极显著(P＜0.05)；肝癌腹水模型中，Ad-mELC／PEG治疗组和单纯Ad-mELC治疗组的平均腹水体积分别为3.8ml和4.3ml，没有明显差异(P＞0.1)，与PBS对照组(15.5ml)相比，统计学差异极显著(P＜0.05)。结果表明Ad-mELC和Ad-mELC／PEG治疗均明显抑制了腹水的生长。腹水中红细胞和肿瘤细胞数计数显示，MethA腹水模型的PBS对照组腹水中的红细胞数为264×10~6／ml，经过Ad-mELC和Ad-mELC／PEG治疗的小鼠腹水中红细胞数均低于40×10~6／ml，比对照组明显减少(P＜0.05)。在肝癌腹水模型中，PBS对照组腹水中的红细胞数为244×10~6／ml，经过Ad-mELC和Ad-mELC／PEG治疗的小鼠腹水中红细胞数均低于100×10~6／ml，比对照组也有明显减少(P＜0.05)。以MethA腹水模型为例，RT-PCR结果显示，仅在Ad-mELC和Ad-mELC／PEG治疗组小鼠腹水中检测到mELC表达。Ad-mELC／PEG和Ad-mELC治疗组腹水中VEGF的含量为175pg／ml和189.3pg／ml，比PBS对照组(660pg／ml)明显降低(P＜0.05)。腹膜渗透性检测结果显示，Ad-mELC／PEG和Ad-mELC治疗组腹水的渗透性明显低于其他对照组(P＜0.01)。但是随治疗时间延长，Ad-mELC治疗组小鼠腹水中mELC表达量下降，而且与抗肿瘤密切相关的IL12和INF-γ的表达也在下降。相反，在Ad-mELC／PEG治疗组中，未检测到上述三种细胞因子表达下降，而且在第三次治疗结束后其表达水平仍高于前两次治疗后测得的表达水平。综上所述，本实验构建了mELC的复制缺陷型重组腺病毒Ad-mELC，并联合PEG-liposome治疗小鼠恶性腹水，结果显示联合脂质体后，Ad-mELC在早期能明显抑制腹水生长，在晚期治疗中，Ad-mELC对小鼠腹水生长有一定作用，并且可以延长荷瘤小鼠生存期，其机理可能是PEG-liposome延长了Ad-mELC在体内表达mELC的时间，从而增强其抗肿瘤作用。该方法在利用腺病毒基因载体治疗恶性肿瘤方面具有进一步探讨的应用价值。