【摘 要】
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目的:研究plumbagin（PL）对肝细胞癌（HCC）细胞的抑制作用;探讨SIVA在PL抑制HCC细胞增殖、促进细胞凋亡中的作用及其机制;分析SIVA在HCC中的表达及其与疾病进展的关系。方法:1.采用CCK-8、Ed U、平板克隆形成实验检测PL对HCC细胞增殖的影响;PI单染检测PL对HCC细胞周期的影响;Annexin V-FITC/PI双染、Western-bolt法检测PL对HCC细胞
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目的:研究plumbagin（PL）对肝细胞癌（HCC）细胞的抑制作用;探讨SIVA在PL抑制HCC细胞增殖、促进细胞凋亡中的作用及其机制;分析SIVA在HCC中的表达及其与疾病进展的关系。方法:1.采用CCK-8、Ed U、平板克隆形成实验检测PL对HCC细胞增殖的影响;PI单染检测PL对HCC细胞周期的影响;Annexin V-FITC/PI双染、Western-bolt法检测PL对HCC细胞凋亡的影响;划痕实验检测PL对HCC细胞迁移的影响;Transwell实验检测PL对HCC细胞侵袭的影响。2.利用RNA-seq技术检测PL处理后HCC细胞全转录组的改变情况,运用Western Blot法检测目的基因在蛋白水平有无相应改变,筛选出目的基因（SIVA）;过表达或干扰SIVA后,通过Western-blot验证其对下游通路m TOR的影响;过表达SIVA观察其在PL抑制HCC细胞增殖、调亡中的作用;建立裸鼠皮下肿瘤模型,PL腹腔注射给药,通过监测移植瘤的生长情况、免疫组化分析PL在裸鼠体内的作用。3.通过Western-blot、RT-PCR、IHC比较HCC细胞株与正常肝细胞,肝癌组织与癌旁组织中的SIVA表达情况;通过对免疫组化染色结果的评分,将TMA病例分为SIVA低表达组和SIVA高表达组,比较两组的临床资料,分析SIVA表达高低与肝癌疾病转归的联系;在线工具扩大研究样本,进一步分析SIVA表达高低与肝癌疾病转归的联系。结果:1.PL处理HCC细胞后,细胞存活率降低,Ed U阳性细胞减少,克隆形成率降低,细胞周期中G2/M时期细胞比例升高,Annexin V-FITC“+”细胞比例增多,cleaved-caspase3和cleaved-PARP蛋白水平表达上调,划痕细胞间距缩小的速度减慢,Transwell细胞比例减少。2.PL引起多种基因和信号通路相关分子转录水平的改变;下调SIVA,m TOR信号通路也受到抑制;过表达SIVA,PL抑制m TOR活性的作用减弱;过表达SIVA,PL抑制HCC细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用削弱;与对照组相比,PL腹腔注射的裸鼠皮下移植瘤的生长速度慢、体积小,SIVA、phospho-m TOR的表达低,Ki67阳性细胞少,Tunel阳性细胞多。3.相较于正常肝细胞,SIVA在HCC细胞中的表达升高;相较于正常癌旁组织,SIVA在HCC癌组织中的表达升高;SIVA高表达患者总体生存率低于SIVA低表达患者。结论:SIVA在PL抑制HCC细胞增殖、诱导细胞凋亡中可能起重要作用,且SIVA的高表达预示较差的临床预后,因此PL可能作为高SIVA表达的肝癌患者的有效药物,提高患者总体生存率,延缓疾病进展。
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