重离子束辐照选育高产乳酸菌株及其发酵工艺技术研究

来源 :中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:china_jjf_wolf
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乳酸是一种重要的多用途有机酸,主要通过微生物发酵生产获得,随着全球乳酸需求量逐年递增,高产乳酸菌种的创制则是乳酸产业创新发展的关键。甜高粱因其具有显著的耐盐碱地的特性,已成为我国西部盐碱地地区重点种植的能源作物,且甜高粱茎秆含有丰富的可发酵性糖,同时也是微生物发酵利用的廉价原料。因此,本论文基于兰州重离子加速器研究装置提供的重离子束诱变育种平台,开展了重离子束(能量为80 Me V/μ12C6+,LET=40 kev/um)辐照乳酸菌,选育高耐受性的突变株,通过过程控制方法的建立,旨在推进甜高粱乳酸的廉价生产。具体研究结果如下:(1)模拟酸水解甜高粱汁的糖分组成,首先测试A69菌株(两轮重离子束诱变筛选获得)利用葡萄糖、果糖以及混合糖(葡萄糖:果糖=1:1)发酵产L-乳酸的能力,结果表明,A69菌株可以很好的利用葡萄糖和果糖为原料生产L-乳酸,进一步说明A69菌株可以利用甜高粱汁生产L-乳酸;其次,引入了纯化策略,使得纯化的甜高粱汁比原始压榨甜高粱汁分别在低糖浓度以及高糖浓度下产酸效率提高了15%和17%;并比较纯化甜高粱汁与原始压榨汁在发酵条件下,A69菌株糖酵解途径的关键酶活,结果发现,以纯化甜高粱汁为原料时,可显著提高A69菌株的己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)的酶活,加速了A69菌株中从葡萄糖到乳酸的代谢流,从而促进L-乳酸高效积累。为进一步降低发酵成本,优化最佳黄豆饼粉添加量为25 g/L,最终在5 L发酵罐中,以纯化的甜高粱汁和黄豆饼粉为原料,A69菌株可积累114.6 g/L的L-乳酸,产酸率为2.61 g/L/h。(2)基于弱化自由基策略,研究了外源添加抗氧化剂维生素C对A69菌株发酵L-乳酸的影响。确定维生素C的最佳添加时间为0 h,且与不添加维生素C的组别相比,L-乳酸产量提高了16%。优化了维生素C的最佳添加浓度为75mmol/L,使得L-乳酸积累量提高31%。通过总抗氧化酶活的测定,发现维生素C添加能显著提升A69菌株的抗氧化能力,以及加速了糖酵解途径中关键酶的活性,从而促进了L-乳酸的高效积累。最终,在1 L发酵罐中,使得纯化甜高粱汁的L-乳酸浓度提升至118.8 g/L,产率为3.71 g/L/h。(3)基于重离子束诱变与压力富集联用策略,获得高耐受菌株G-1和G-10,其摇瓶发酵验证表明,在高糖和低糖浓度条件下,L-乳酸的积累较A69菌株都显著提升,分别为20%、13.89%和12.21%、10.32%;且高耐受菌株的糖酵解途径中的关键酶活性,均高于A69菌株;在5 L发酵罐中,G-1菌株利用甜高粱汁为原料,可以生产126.1 g/L的L-乳酸,产酸率为3.5 g/L/h。为进一步提高乳酸产量以及菌株耐受性,利用微生物液滴培养系统对G-1菌进行不同Na Cl浓度梯度耐受性驯化,最终选育得到耐受菌株GS-7、GS-8和GS-10,其L-乳酸积累能力分别比G-1菌株分别提高了7.83%、10.5%和15.88%;在5 L发酵罐中,GS-10菌株以甜高粱汁为原料,最终生产129 g/L的L-乳酸,产酸率提升为4.03 g/L/h。
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