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心血管疾病是世界上严重危害人民生命和健康的疾病之一，其发病率和死亡率均居各种疾病前列，动脉粥样硬化（Atherosclerosis，As）是心血管疾病的主要病理基础。近年来研究发现，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）增殖形成As病变是As发生、发展的重要步骤，As也可能是一种VSMCs的良性肿瘤，其发生、发展取决于细胞增生和凋亡这对矛盾相互作用的结果，因此有效地控制VSMCs增殖已成为治疗As的一种手段。丹皮酚（paeonal， Pae）是毛茛科植物牡丹Paeorcia Suffruficoas Andr的干燥根皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchum paniculatium(Bunge) Krtag 的主要活性成分，我们已有大量研究证实Pae对As模型的形成和发展过程有一定干预作用。本研究在培养家兔主动脉平滑肌细胞的基础上，观察Pae体内和外给药抑制VSMCs增殖、诱导凋亡及对相关基因表达调控的影响，从分子机制及As发生发展的重要环节来探索Pae对As的作用及作用特点。
目的:探索高效快速的家兔血管平滑肌细胞体外原代培养及传代技术，为分子生物学实验提供足量可靠的细胞来源；体外和体内给药观察Pae对家兔VSMCs增殖的抑制作用及细胞周期调控机制；观察Pae对体外培养的家兔VSMCs凋亡的诱导作用及其分子机制。
方法：采用组织块预消化法对家兔血管平滑肌细胞进行培养，倒置显微镜下观察细胞生长情况，台盼蓝染色检测细胞活性，免疫组化法鉴定血管平滑肌细胞。家兔灌胃Pae150mg/kg制备含药血清，MTT法测定Pae对VSMCs增殖的抑制作用，流式细胞仪分析细胞周期分布特征。相差显微镜和荧光显微镜观察Pae对VSMCs形态学的改变，流式细胞仪分析VSMCs凋亡率，免疫组化检测VSMCs p53、C-myc蛋白表达。
结果:
1． 组织块预消化法培养家兔血管平滑肌原代细胞
组织块经0.15％胶原酶液消化6h后贴壁培养，细胞生长密度高，速度较快，纯度相对较高，原代培养时间为7d～10d。
2．Pae体外给药对VSMCs增殖的抑制作用
以Pae100、150及200mg/L三种浓度分别作用于VSMCs 24h、48h、72h，结果发现以上三种浓度在24h时即可对VSMCs的增殖呈现出明显的抑制作用，且在72h内对VSMCs的增殖持续保持明显的抑制作用。
3.Pae含药血清对VSMCs增殖的抑制作用
以15％、20％、25％三个浓度的含药血清分别作用于VSMCs24h、48h、72h，结果发现以上三种浓度在24h时即可对VSMCs的增殖呈现出明显的抑制作用， 25％含药血清作用于VSMCs 24h、48h、72h的抑制率分别为36.3％、66.5％、80.1％，抑制效应呈时间依赖性； 20％含药血清在72h内对VSMCs的增殖持续保持明显的抑制作用； 15％含药血清在72h内随着时间的增加其抑制作用逐渐减弱。
4.Pae体外给药对VSMCs周期的调控作用
Pae31.25、62.5及125mg/L三种浓度组S期和G2/M期的细胞所占比例显著小于对照组；对照组中G0/G1期的细胞所占比例减少，Pae31.25、62.5及125mg/L三种浓度组G0/G1期的细胞所占比例显著高于对照组。
5．Pae体外给药对VSMCs形态学改变
相差显微镜下观察发现，VSMCs传至4～6代代融合时，胞体细长，呈长的梭形，多层生长，具有典型的“峰”，“谷”现象。加含Pae 31.25mg/L的10％胎牛血清的DMEM培养液后，VSMCs与对照组相比，发生不同程度的收缩，细胞连接疏松，细胞间间隙扩大，细胞体积变小，胞浆皱缩呈多角形，或星芒状，个别胞核皱缩，或模糊不清。“峰”，“谷”现象尚存。而Pae 62.5、125 mg/L实验组，VSMCs明显收缩，大多数细胞浆皱缩，细胞间连接疏松，甚至细胞变圆附于其它细胞上，在谷的位置VSMCs稀疏，部分脱落；而“峰”处细胞较多，收缩呈簇。荧光显微镜下观察，实验组可见早期凋亡细胞，表现为细胞核为AO 染色呈黄绿色荧光，浓聚成新月形或颗粒状，位于细胞的一侧。
6．Pae体外给药对VSMCs凋亡率的影响
Pae作用VSMCs 36h后，流式细胞仪检测结果表明，Pae 31.25、62.5和120mg/L浓度组的DNA直方图可见到较明显的亚二倍体峰（Sub－G1峰），其凋亡率分别为(5.83±0.21)％、(7.14±0.71)％和(6.72±0.39)％；空白对照组的凋亡率为(2.06±0.23)％。Pae31.25、62.5及120mg/L三种浓度组与空白对照组比较凋亡率明显增加。
7.Pae体外给药对VSMCs p53、C-myc蛋白表达的影响
Pae 62.5和120mg/L浓度组可使VSMCs的p53蛋白表达显著增加，而C-myc蛋白表达明显下调。
结论：
家兔主动脉组织块经0.15％胶原酶液消化6h后贴壁培养的方法可为分子生物学实验提供足量可靠的细胞来源。Pae一定浓度体内、外给药均可抑制VSMCs增殖，通过增加G0/G1期细胞所占比例和减少S期细胞所占比例阻止VSMCs细胞周期由G0/G1期向S期推进。Pae在一定浓度范围内可以呈剂量依赖性诱导VSMCs发生凋亡，该作用与上调p53蛋白和下调C-myc蛋白表达有关。