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中草药相关肝损伤（Herb induces liver injury,HILI）,即发生肝损伤的原因与中草药有关,具体是指中药或天然药物及制剂导致的直接或间接肝脏损害。常常是导致中草药相关制剂研发失败、上市后被撤市或限制使用的重要原因,也是诱发肝脏疾病的主要因素之一[1],我国以中草药或其制剂引起的肝损伤受到广泛关注[2],因此正确认识中药肝损伤的作用机制十分重要。痔血胶囊的药物组成包括白鲜皮和苦参,此二味药对出现于苦参散（《太平圣惠方》）中,有清热解毒、燥湿止痒、凉血止血之功,对于痔疮便血、肛门疼痛、便秘等症具有良好疗效。痔血胶囊于2003年批准上市,由于收到诸多肝损伤不良反应报告,最终2008年停产召回,对于其研究有助于了解中药不良反应发生机制,以指导中药新药的研发和临床安全用药。近年来肠道菌群失调与肝脏疾病的关系日益受到关注,肠道菌群是影响肝脏代谢的重要因素。研究表明,通过调节肠道微生态能够减轻肝损伤严重程度[3-6]。本课题在国家自然科学基金项目（81274181）的资助下从口服药物肠-肝吸收代谢轴的基础理论出发,通过肠道菌群、代谢组学进行毒理学研究,对痔血胶囊致大鼠肝毒性的作用机制进行探讨。1研究目的观察痔血胶囊干预Wistar大鼠的肝毒性作用,从口服药物肠-肝吸收代谢轴的生理基础理论出发,利用肠道菌群和代谢组学的研究手段,探索痔血胶囊致大鼠肝毒性及作用机制。2研究方法2.1毒性确证试验本研究制备了痔血胶囊原方作为受试药,以无特定病原体（SPF级）Wistar大鼠作为受试对象,设立低剂量组（4.125g生药/kg）、中剂量组（8.25g生药/kg）、高剂量组（16.5g生药/kg）不同浓度剂量的毒性试验,空白对照组以同体积的去离子水作为对照,所有药物均模拟口服进行灌胃给药。根据课题组前期实验结果,给药时间定为4周,观察记录大鼠活动、精神状态,异常情况,每周固定时间检测大鼠体重和进食量。给药4周后,收集空白对照组、痔血胶囊低、中、高剂量组大鼠血清、肝脏行血清生化学、组织病理学检测,评估痔血胶囊的肝毒性。2.2肠道菌群研究收集大鼠粪便,进行DNA的提取,采用PCR法对大鼠粪便16S rDNA的V3-V4可变区进行扩增,运用Illumina高通量测序技术平台对大鼠粪便测序。进行测序的统计分析,重点以α多样性、β多样性和组间差异比较分析痔血胶囊肝毒性大鼠的肠道菌群分布结构、多样性特征及差异菌群。2.3代谢组学分析将空白对照组与痔血胶囊给药高剂量组大鼠的血清进行超高效液相色谱仪-四级杆轨道离子阱质谱联用（UPLC-Q-Exactive-MS）检测,并对结果进行多元变量统计分析,找出差异代谢物进一步分析代谢通路,揭示痔血胶囊肝毒性的潜在作用机制。3研究结果3.1肝脏毒理学研究①痔血胶囊各剂量组给药28天后出现肝脏系数改变,肝脏重量增加。具体表现为随着剂量增大大鼠肝脏重量、肝脏系数越大。其中痔血胶囊中剂量组、痔血胶囊高剂量组肝脏重量增加,与空白对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;雌性大鼠中痔血胶囊各给药组与空白对照组相比肝脏系数呈剂量依赖性增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,雄性大鼠中痔血胶囊中剂量组、痔血胶囊高剂量组与空白对照组相比肝脏系数增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。②肝脏病理学改变表现为各给药组大鼠肝脏轻微至轻度的肝细胞脂肪变性,主要表现为肝小叶1带和2带（周边带和中间带）肝细胞内微小空泡;与空白对照组相比,痔血胶囊各剂量组动物肝脏肝细胞脂肪变性发生例数增加,病理评分升高,病变程度呈加重趋势。3.2肠道菌群研究将痔血胶囊肝毒性大鼠粪便进行高通量测序,共得到用于分析的3210293个有效序列,平均长度417bp,OUT聚类1913个,其中门水平28个,纲水平65个,目水平152个,科水平269个,属水平567个,种水平956个。大鼠肠道菌群在门水平的组成主要为拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、弯曲杆菌（Campilobacterota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacte riota）。α多样性分析示给药后Sobs指数、Chao指数、Ace指数升高,Shannon指数、Simpson指数变化不明显。Wistar大鼠低、中、高剂量给药28天后菌群丰富度增加,菌群相对含量发生变化,主要表现在拟杆菌门、放线菌门的相对含量增高和厚壁菌门、弯曲杆菌的相对含量降低。经LEFse分析不同组间差异菌群有兰氏菌科（Lanchnospiraceae）＿NK4A136＿group、胃瘤球菌（Ruminococcus）、链球菌（Allobaculum）、粪球菌（Faecalibaculum）、巴氏杆菌（Parabacteroides）等10个菌种。3.3代谢组学研究使用UPLC-Q-Exactive-MS技术分析痔血胶囊高剂量组与空白对照组的血清代谢组学的差异,通过PCA分析和OPLS-DA对数据进行降维,以VIP值>1 P值<0.05筛选差异代谢物,共得到51种差异代谢物,其中正离子模式下鉴定出29中潜在差异代谢物,负离子模式下鉴定出24种潜在差异代谢物,10-姜油（10-Gingerol）和吲哚乙酸（Indoleacetic acid）在正负离子模式下均被鉴别出。差异代谢物包括多种肉碱、鞘氨醇、牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸。相关通路涉及鞘脂代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢等16条通路。4研究结论1痔血胶囊原方连续给予Wistar大鼠28天,大鼠出现肝毒性,其严重程度与给药剂量呈正相关;2给药后大鼠肠道微生物物种丰富度增加,菌群构成发生变化,降低了厚壁菌门和拟杆菌门比例,可能与胃瘤菌、毛螺旋菌等;3肝毒性可能与产丁酸菌含量下降,短链脂肪酸合成受限进而影响能量、脂质代谢有关。