多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是一种革兰阴性病原菌,根据荚膜抗原不同可分为A、B、D、E和F 5种荚膜血清型,可导致多种家禽、家畜、甚至是人类患病。在牛群中,A型多杀性巴氏杆菌主要导致呼吸系统疾病,引起牛肺炎,给养牛业造成了巨大的经济损失。目前,针对牛多杀性巴氏杆菌病的防治方法主要是疫苗和抗生素,但国内只有针对牛出血性败血症的B型疫苗,尚无针对A型的有效疫苗,且不同血清型间疫苗交叉保护作用较低。此外,抗生素治疗导致耐药、环境污染等问题,这也给该病的防治带来了较大挑战。因此,研发更安全有效的化合物对防治P.multocida感染具有重要的理论意义和实际意义。本课题组前期研究发现,牛源A型多杀性巴氏杆菌Pm CQ2感染后,经RNA-seq分析,小鼠肺组织中大量差异表达基因富集在丝氨酸和色氨酸等氨基酸代谢相关通路上;且感染前后小鼠肺组织中游离氨基酸含量发生显著变化。外源丝氨酸能够降低Pm CQ2感染后小鼠肺组织及巨噬细胞中炎性细胞因子的分泌,但对Pm CQ2没有直接的抑制作用,提示丝氨酸可能是通过影响宿主免疫反应从而抵抗Pm CQ2感染,但具体机制仍不清楚。此外,Pm CQ2感染后色氨酸代谢通路显著性富集,尤其是其下游代谢产物-褪黑素代谢途径重塑,包括褪黑素代谢相关酶显著上调,肺组织和血清中褪黑素含量降低,提示褪黑素在Pm CQ2感染过程中起重要作用。因此本研究主要探究L-丝氨酸及色氨酸代谢产物-褪黑素在Pm CQ2感染过程中的具体作用及其机制。主要结果如下:1.L-丝氨酸通过调节巨噬细胞和/或中性粒细胞介导的炎症以抵抗多杀性巴氏杆菌感染补充2 mg/kg外源L-丝氨酸可以显著提高小鼠的存活率,减少Pm CQ2在小鼠肺部的定殖量,并降低Pm CQ2感染期间小鼠肺组织病变及炎症反应。小鼠肺组织转录组学测序分析结果提示,巨噬细胞是Pm CQ2感染后富集最为显著的免疫细胞。通过氯磷酸盐脂质体清除小鼠肺泡巨噬细胞后,发现L-丝氨酸的抗炎作用受到抑制,但并未完全被抑制,同时中性粒细胞代偿性增加了。随后,利用抗Ly6G的单克隆抗体清除中性粒细胞,结果与清除巨噬细胞一致,L-丝氨酸的抗炎作用受到部分抑制,而巨噬细胞代偿性增加。同时清除肺泡巨噬细胞和中性粒细胞后,免疫组化和ELISA实验结果显示L-丝氨酸抗Pm CQ2感染诱导的过度炎症的作用完全消除,以上结果表明L-丝氨酸可抑制巨噬细胞和中性粒细胞介导的炎症反应。2.L-丝氨酸重编程巨噬细胞转录和代谢抑制巨噬细胞向促炎M1型极化为探究L-丝氨酸对Pm CQ2诱导的巨噬细胞炎症的抑制机制,本研究进行了细胞功能分析。体外研究发现,添加10 m M L-丝氨酸不影响巨噬细胞的细胞活性和NO的产生,但显著抑制Pm CQ2（MOI=1）感染和经典的LPS+IFN-γ（1μg/m L+20ng/m L）激活的巨噬细胞中炎症细胞因子的分泌（IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-17）。通过Western blot进一步分析L-丝氨酸作用的具体信号通路,结果发现L-丝氨酸显著抑制炎性小体NALP1、AIM2、NLRP3（Caspase-1）和NLRC4的激活以及HIF-1α的表达。巨噬细胞转录组学测序结果发现L-丝氨酸重编程巨噬细胞的转录,显著差异基因主要涉及物质的生物合成和代谢（氨基酸）。RT-PCR验证结果与转录组测序结果一致,表明L-丝氨酸可能主要影响巨噬细胞的代谢过程。随后进行了巨噬细胞的代谢组学检测分析,结果发现L-丝氨酸处理后导致大量差异代谢物,包括较低水平的葡萄糖、异麦芽糖、乳糖、纤维二糖和果糖等。KEGG功能富集分析结果显示L-丝氨酸主要影响炎性巨噬细胞半乳糖、淀粉-蔗糖和果糖-甘露糖代谢。细胞能量代谢检测进一步发现10 m M L-丝氨酸显著抑制巨噬细胞的糖酵解过程,而对其氧化磷酸化水平几乎没有影响。这一结果表明10 m M L-丝氨酸通过抑制巨噬细胞的糖酵解过程抑制其向M1型极化。3.色氨酸代谢产物-褪黑素抗多杀性巴氏杆菌感染为了探究色氨酸代谢产物-褪黑素在Pm CQ2感染中的作用,在本研究中,首先探索了褪黑素的预防作用。通过腹腔注射方式连续6天或7天外源补充褪黑素（30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg）,然后通过腹腔接种Pm CQ2（2.2×10~5 CFU）。紧接着探索了褪黑素的治疗作用,先用2.2×10~5 CFU的Pm CQ2腹腔感染小鼠,再分别用30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg的褪黑素经腹腔注射4次（第1次为感染后30 min,之后每隔6 h注射1次,共注射3次）。结果发现补充外源褪黑素（30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg）显著提高Pm CQ2感染后小鼠的存活率,降低小鼠肺部细菌定殖量,减少小鼠肺组织和血清中促炎细胞因子的含量,且预防和治疗结合抗感染效果更好。4.色氨酸代谢产物-褪黑素靶向革兰阴性菌Ⅱ型柠檬酸合酶抑制病原菌本研究进一步发现,褪黑素可以直接抑制Pm CQ2生长,且具有广谱抑菌作用。转录组测序及分析结果发现差异表达基因主要富集在膜转运和糖代谢相关通路上。此外,褪黑素可增加细菌细胞膜通透性,导致蛋白质和糖类等大分子物质泄漏。扫描电镜和透射电镜结果进一步发现褪黑素导致细菌细胞膜出现褶皱、凹陷、孔洞和空化,表明褪黑素能破坏细菌细胞膜完整性。代谢组学分析结果表明大量差异代谢物主要富集在三羧酸循环通路中,且褪黑素处理后乙酰辅酶A和丙酮酸这两个上游底物上调,而柠檬酸这一下游产物反而下调。进一步实验发现褪黑素抑制这一过程中的关键酶-柠檬酸合酶的活性。然后,构建柠檬酸合酶（glt A）基因缺失株（MG1655Δglt A）和回补株（MG1655Δglt A/Pglt A）,再次进行体外抑菌实验,发现与野生株和回补株相比,褪黑素不影响缺失株MG1655Δglt A细胞膜的通透性,表明褪黑素通过抑制柠檬酸合酶活性减少柠檬酸的含量,进而影响细菌的生长繁殖。为探究褪黑素具体如何影响柠檬酸合酶,本研究利用原核表达系统表达纯化了Ⅱ型柠檬酸合酶,通过表面等离子共振分析（LSPR）发现,与II型柠檬酸合酶已知的抑制剂NADH相比(结合能:1.77×10-4 mol/L),褪黑素与II型柠檬酸合酶（阴性菌）具有更高的亲和力(结合能:7.62×10-5 mol/L),而与I型柠檬酸合酶（商业化产品作为对照）几乎不结合。同源建模和计算机分子对接分析发现褪黑素与II型柠檬酸合酶的N361、L301、M302和H265这四个氨基酸残基形成疏水作用,并与D363、R300、P263和R307形成氢键;其中,R300、D363和H265作用力较其他几个更强,且R300＞D363＞H265。因此,对这三个位点进行点突变,并表达纯化了突变体CS（R300A）、CS（R300A、D363A）和CS（R300A、D363A、H265A）。最后LSPR分析发现这三个突变体与褪黑素的亲和力显著下调,分别为1.83×10-4、2.65×10-4和2.83×10-4 mol/L,表明褪黑素直接靶向革兰阴性菌II型柠檬酸合酶的R300、D363和H265位点,且R300位点可能起主要作用。上述结果表明L-丝氨酸通过重编程细胞转录和代谢调控巨噬细胞极化状态来抑制Pm CQ2诱导的过度炎症,为预防病原菌感染提供了新的营养策略;色氨酸代谢产物-褪黑素通过靶向革兰阴性菌II型柠檬酸合酶R300位点来抑制其酶活,降低柠檬酸合成从而影响细菌的的生长,为细菌感染性疾病防控及抗菌新药研发提供了新的作用靶点及研究思路。