双生病毒是一类在全球范围广泛发生的单链环状DNA病毒,可侵染多种经济作物并造成严重损失。双生病毒基因组共编码6-8个蛋白,分别参与病毒基因组DNA复制、转录、组装、移动和介体昆虫传播等过程,其中,在双生病毒科（Geminiviridae）中,只有菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）、曲顶病毒属（Curtovirus）、芜菁曲顶病毒属（Turncurtovirus）和番茄伪曲顶病毒属（Topocuvirus）的成员编码C4/AC4蛋白。C4/AC4蛋白作为双生病毒编码的一个最小蛋白质,其功能却十分强大,可作为症状决定因子,此外还参与病毒运动,作为TGS和PTGS抑制子打破寄主防御,可与多种寄主因子直接互作行使其功能等。目前C4/AC4蛋白作为一个多功能蛋白,其如何与寄主植物互作发挥功能还有待进一步探索。胜红蓟（Ageratum conyzoides）是我国西南地区广泛分布的一种杂草,由于其生活史长、生命力强和分布范围广的特点,目前已成为重要的双生病毒中间寄主,在病毒的传播和进化过程中扮演着重要角色。本论文以采自四川省表现叶片卷曲症状的胜红蓟样品为研究材料,从中分离鉴定到一个双生病毒新种——四川胜红蓟曲叶病毒（ageratum leaf curl Sichuan virus,ALCScV）,并对其致病性开展了相关研究;借助马铃薯X病毒（potato virus x,PVX）介导基因表达及点突变策略分析C4蛋白对病毒症状及积累量的影响;并以C4蛋白为诱饵,筛选得到与C4存在直接互作的GA通路负调控因子NbGAI,明确了C4蛋白通过竞争性结合NbGAI蛋白进而抑制NbGAI蛋白降解;基于VIGS及外源GA3处理明确了GA参与抵御ALCScV侵染;通过选取不同致病类型的双生病毒C4蛋白与NbGAI开展研究,明确了双生病毒C4蛋白调节GA信号通路促进病毒侵染可能是双生病毒普遍存在的致病机制。本论文的主要研究结果如下:1、ALCScV致病性鉴定及其编码的C4蛋白功能初探对采自四川地区表现叶片严重卷曲症状的胜红蓟样品,采用双生病毒通用引物PA/PB进行PCR检测,结果表明该样品受到双生病毒侵染。进一步设计特异性引物扩增得到病毒基因组全序列,序列比对分析发现该病毒是Begomovirus的一个新种,根据国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）对该属病毒的命名原则,将其命名为四川胜红蓟曲叶病毒（ageratum leaf curl Sichuan virus,ALCScV）。分别采用双生病毒alpha卫星和beta卫星分子通用引物UNA101/UNA102和β01/β02β进行PCR扩增,证明ALCScV是单组分病毒,不伴随卫星分子。采用无缝克隆的方式构建ALCScV的侵染性克隆,农杆菌浸润接种发现该病毒可以在本氏烟、胜红蓟和向日葵上引起严重的叶片卷曲和植株矮缩症状。伴随异源β卫星共同接种本氏烟,结果表明,异源β卫星可以诱导ALCScV产生更严重的症状和显著增强病毒积累水平。为了明确ALCScV编码的6个蛋白的致病性,借助PVX表达载体对这7个基因分别进行过表达研究,结果表明过表达V2、C1、C4和C5可在本氏烟上引起严重症状。针对C4蛋白致病性进一步研究发现,接种PVX-C4的本氏烟植株表现茎秆扭曲及叶片增生症状,且qRT-PCR结果表明PVX-C4接种植株中其PVX的表达量较PVX空载体接种植株显著性增加;在接种后35天（days post inoculation,dpi）,接种PVX-C4的本氏烟植株表现花发育畸形及开花时间显著延迟。突变研究结果表明,将ALCScV C4蛋白缺失（ALCScV-mC4）后,不影响病毒的侵染,但病毒侵染导致的叶片卷曲和植株矮缩症状完全消失,且ALCScV-mC4接种植株中病毒积累水平较ALCScV接种植株显著性减少。综上结果表明,ALCScV C4蛋白对病毒侵染及症状形成具有至关重要的作用。2、与ALCScV C4蛋白互作的GA通路因子的筛选赤霉素（Gibberellin）作为一类重要的植物内源激素,在调控植物的株高和花发育过程中起着关键作用。ALCScV侵染可引起本氏烟严重的矮缩和花发育畸形症状,为了明确ALCScV侵染对本氏烟内源GA的影响,采用qRT-PCR对ALCScV侵染后GA通路相关基因表达情况进行验证,结果表明,与对照植株相比,ALCScV接种植株中GA通路相关基因GA20、GA-3β、PIF3和PIF4的表达量显著降低;通过高效液相色谱法对本氏烟植株内源GA含量测定发现,ALCScV侵染显著降低了本氏烟中内源GA含量,而ALCScV-mC4突变体接种后,其内源GA含量较对照植株相比无显著性差异;与此同时,单独过表达C4同样引起本氏烟内源GA含量显著性的降低。综上结果表明,ALCScV侵染会影响本氏烟GA通路,而ALCScV C4蛋白是主要影响因子。利用酵母双杂交（Yeast two Hybrid,Y2H）、双分子荧光互补实验（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）和免疫共沉淀实验（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术证实ALCScV编码的C4蛋白直接与本氏烟GA通路负调控因子NbGAI存在直接互作。结构域分析显示NbGAI蛋白主要包含两个保守的结构域,分别是N端的DELLA结构域和C端的GRAS结构域;互作关键区段验证发现NbGAI蛋白第98-566位氨基酸区段是其与C4蛋白互作的关键区段,而C4蛋白第84-100位氨基酸区段是其与NbGAI蛋白互作的关键区段;亚细胞定位分析表明NbGAI蛋白主要定位于细胞核,少量分布于细胞质,而C4蛋白主要定位于细胞质,少量分布于细胞核;保守结构域分析发现,不同物种的GAI蛋白结构域相对保守。3、本氏烟NbGAI对ALCScV侵染的影响为了明确NbGAI基因对GA通路的影响,采用PVX介导NbGAI基因在本氏烟中系统过表达,结果表明过表达NbGAI引起本氏烟内源GA含量显著性的降低;对本氏烟株高进行测量发现,与PVX空载体接种植株相比,PVX-NbGAI接种植株表现出显著的植株矮缩症状。为了明确NbGAI基因对ALCScV侵染的影响,在过表达NbGAI基因7 d后挑战接种ALCScV,在接种ALCScV 14 d后,与接种PVX/ALCScV的本氏烟植株相比,接种PVX-NbGAI/ALCScV的本氏烟植株表现更加严重的叶片卷曲症状。对ALCScV积累量进行检测发现,接种PVX-NbGAI/ALCScV的本氏烟植株中病毒积累量显著高于PVX/ALCScV接种植株。随后采用TRV介导NbGAI基因系统沉默,在7 dpi,接种TRV-NbGAI的本氏烟植株表现出明显的过度生长表型,这与GA敏感性表型一致;此外,沉默NbGAI可以显著增加植株高度,且开花时间提前;对其内源GA含量进行测定发现,沉默NbGAI可以显著性增加本氏烟中内源GA含量;在沉默NbGAI 7 d后,挑战接种ALCScV,症状观察发现,接种TRV-GUS/ALCScV的植株表现出严重的叶片卷曲症状,而接种了TRV-NbGAI/ALCScV的本氏烟植株仅表现出轻微的叶片皱缩症状;病毒积累量检测发现,与接种TRV-GUS/ALCScV的对照植株相比,接种TRV-NbGAI/ALCScV的植株中病毒积累量显著降低。最后,外源GA3处理可以回补由ALCScV侵染所导致的植株矮缩和开花时间延迟现象,qPCR检测发现,外源GA3处理可以显著抑制ALCScV积累水平。综上结果表明,NbGAI对于ALCScV侵染具有促进作用,且GA3能有效抑制ALCScV的侵染。4、ALCScV C4与NbGID2竞争性结合NbGAI在植物体内,GAI蛋白通过与GID2蛋白互作进而被26S蛋白酶体识别降解。本研究通过Y2H和BiFC验证发现在本氏烟中NbGAI蛋白同样与NbGID2蛋白存在互作,并明确NbGAI蛋白第98-566位氨基酸区段是其与NbGID2蛋白互作的关键区段;MG132及GA3处理结果表明NbGAI蛋白的降解也是依赖于26S蛋白酶体途径。为了解析C4蛋白与NbGAI蛋白互作的分子机制,通过竞争性BiFC实验及竞争性pull-down实验进行验证,结果表明C4蛋白与NbGID2蛋白竞争性结合NbGAI蛋白;进一步对NbGAI蛋白的稳定性进行研究发现,当有C4蛋白存在的情况下,可以显著增强NbGAI-GFP的荧光强度,且在MG132及GA3处理下均得到同样的结果;Western blot结果表明,与单独接种pCV-NbGAI-GFP的叶片相比,共接种pCV-NbGAI-GFP和pCV-C4-His的叶片中NbGAI蛋白表达水平显著增高,qRT-PCR和半定量检测结果表明C4并不影响NbGAI基因的表达;此外,C4在转录及蛋白水平均不影响GFP的表达,综合以上研究表明,C4蛋白是通过抑制NbGAI蛋白的降解来维持NbGAI蛋白的稳定。采用不同浓度pCV-C4-His菌液与pCV-NbGAI-GFP菌液共浸润接种发现,C4抑制NbGAI蛋白的降解依赖于C4蛋白剂量。进一步选取ALCScV C4蛋白不与NbGAI蛋白互作的C41-83突变体进行研究,结果表明共浸润接种C41-83-His不影响NbGAI-GFP的荧光强度及蛋白积累水平。综上研究结果表明C4蛋白抑制NbGAI蛋白的降解依赖于二者互作。5、不同双生病毒C4蛋白与NbGAI互作研究为了验证C4蛋白调节GA信号通路促进病毒侵染的机制在双生病毒中是否普遍存在,分别选取烟草曲茎病毒（tobacco curly shoot virus,TbCSV）和赛葵黄脉病毒（malvastrum yellow vein virus,MaYVV）的C4蛋白进行研究,结果发现TbCSV和MaYVV C4蛋白均可以与NbGAI蛋白互作;互作关键区段验证发现NbGAI蛋白与TbCSV C4和MaYVV C4互作的关键区段均是其98-566位氨基酸;在沉默NbGAI的植株上挑战接种TbCSV后进行症状观察发现,沉默NbGAI可以显著减轻由TbCSV侵染引起的叶片卷曲症状;病毒积累水平检测发现,沉默NbGAI可以显著抑制TbCSV的积累;在沉默NbGAI的植株上挑战接种MaYVV及其β卫星（malvastrum yellow vein betasatellite,MaYVB）,症状观察发现,沉默NbGAI可以显著减轻MaYVV/MaYVB诱导的叶片卷曲和黄脉症状;对MaYVV积累量检测发现,与对照植株相比,沉默NbGAI可以显著抑制MaYVV的积累。综上研究结果表明TbCSV C4和MaYVV C4蛋白均可以与NbGAI蛋白直接互作,且NbGAI对于TbCSV和MaYVV的侵染具有正调控作用。综上,本研究从表现叶片卷曲症状的胜红蓟样品中分离鉴定到Begomovirus的一个新种ALCScV,该病毒可在多种植物上引起叶片卷曲、植株矮缩等严重症状;致病性及突变研究表明ALCScV编码的C4蛋白是一个症状决定因子;进一步研究发现C4蛋白与本氏烟寄主GA通路负调控因子NbGAI蛋白直接互作,C4与NbGAI的互作干扰了由NbGID2介导的NbGAI蛋白泛素化降解,从而阻断了GA信号通路,导致感病植株表现严重的矮化和花发育异常症状;沉默NbGAI及外源GA3处理显著抑制ALCScV侵染。本研究首次揭示了双生病毒C4蛋白通过干扰宿主GA信号通路来调控病毒侵染和症状形成的新机制。