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目的： 利用依赖辅助病毒或宿主细胞内合成核糖核蛋白复合体（vRNPs）的反向遗传学系统表达外源增强型绿色荧光蛋白（EGFP），检测所构建的RNA聚合酶 I系统的可行性；构建基于流感病毒H1N1分离株A/Puerto Rico/8/34基因组的双向反向遗传学系统，包装子代病毒，为新型流感病毒疫苗的研制提供新的思路和研发平台。 方法： 1.采用PCR技术扩增EGFP、人RNA PO L I启动子（PIh）及鼠源终止子（tI）序列，将EGFP精确插入PIh和tI之间，构建RNA POL I系统及重组质粒pBluescript II sk-tI-EGFP-PIh，转染辅助病毒感染的MDCK细胞，使用荧光显微镜观察荧光。 2.流感病毒A/Puerto Rico/8/34的PA、PB1、PB2、NP基因cDNA分别克隆到表达载体 pcDNA3.1上，获得重组表达质粒 pcDNA3.1-PA/PB1/PB2/NP，将pBluescript II sk-tI-EGFP-PIh与表达质粒共转染293T细胞，观察荧光。 3. RNA POL I系统定向插入 pcDNA3.1，构建双向反向遗传学系统；将A/Puerto Rico/8/34基因组cDNA克隆入双向反向遗传学系统获得重组质粒，并共转染 MDCK+293 T细胞，接种鸡胚收获病毒粒子。病毒粒子经实时荧光定量RT-PCR等进行鉴定和分析。 结果： 1.本实验中重组质粒均经菌液PCR和测序验证正确。 2.在依赖辅助病毒或宿主细胞内合成vRNPs的转染实验组中，转染12h时均可观察到荧光现象，细胞培养至48 h时，荧光强度达到最大，表明所设计的RNA PO L I系统有效；但其荧光强度与阳性对照组相比较低。将双向反向遗传学系统的重组质粒共转染 MDCK+293T细胞，收集细胞及上清液并接种鸡胚，对收集的羊水及尿囊液进行红细胞凝集试验，基于POL I系统1和2获得的一代羊水血凝效价分别为1:4和1:8。将一代羊水二次接种鸡胚，随后进行血凝试验得出基于POL I系统2获得的二代羊水出现红细胞凝集，经RT-PCR等检测和分析确定该系统可包装A/Puerto Rico/8/34的子代病毒。 结论： 依赖辅助病毒和宿主细胞内合成 vRNPs的反向遗传操作系统均可使外源EGFP在哺乳动物细胞中表达，表明所设计的RN A POL I系统有效，但蛋白表达量较低；基于RNA PO L I系统2，成功构建双向反向遗传学系统，并获得A型流感病毒子代病毒。