研究背景：动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是由多种因素导致的慢性血管性疾病,是心脑血管疾病的病理基础,内皮细胞功能障碍是AS的始动环节,保护血管内皮对于AS的早期防治意义重大。关于AS的发病机制存在不同方面的学说,主要包括脂质浸润学说、炎症反应学说、损伤反应学说、血栓源学说及天然免疫假说等。脂质浸润学说认为AS的产生主要由脂质代谢失常引起,由高血脂所致的内皮功能障碍、炎症反应、氧化应激等亦被认为是动脉粥样硬化斑块形成的病理基础。随着铁代谢与AS的相关性研究逐渐增多,铁在AS进展中的促进作用已得到证实,在AS的初期出现斑块内铁沉积增多,通过限铁饮食或铁螯合剂治疗则可减少铁沉积、延缓AS及增强斑块稳定性,对心脑血管疾病起到保护作用。近年来,因一种调控机体铁稳态的关键物质一铁调素(hepcidin)的发现,研究者们对机体铁代谢的分子机制有了更深入的认识,hepcidin异常表达所致铁过负荷对心血管疾病的影响逐渐成为研究热点。Hepcidin是铁的自我平衡调节器,而机体的铁稳态主要受hepcidin与膜铁转运蛋白1(ferroportin, FPN1)调控,FPN1是hepcidin的受体以及调控点,它是细胞铁输出的效应器,在细胞铁释放中发挥重要作用,hepcidin通过与细胞表面的FPN1结合,诱导其内化降解来调控细胞内的铁,hepcidin表达的异常可导致机体铁代谢紊乱。现有研究发现hepcidin在AS斑块中高表达,可使巨噬细胞内的铁沉积增多,促进斑块的不稳定性,说明hepcidin与AS斑块内的铁沉积及斑块稳定性密切相关。已有研究证实铁过负荷可引起小鼠的血脂代谢紊乱,可见铁代谢异常与高脂血症之间具有密切的联系,但是二者之间究竟是如何相互影响?高血脂可否通过诱导hepcidin异常表达影响铁代谢参与血管内皮损伤,进而影响AS进程?这个过程与高脂血症伴随炎症反应是否有关?而通过干预hepcidin-ferroportin是否影响AS发生发展过程,目前尚无研究报道。Maura Poli等发现,肝素可通过抑制BMP/SMAD及JAK/STAT两条通路来抑制hepcidin的表达,进而影响机体的铁代谢。肝素是一种粘多糖硫酸酯类抗凝血药,除抗凝作用外,还可通过抑制平滑肌细胞迁移和增殖、调节血脂代谢、保护血管内皮等作用以抑制AS的发生发展,但肝素在临床常用注射给药的方法,且易引起自发性出血等不良反应,在一定程度上限制了其临床使用。而活血化瘀中药现广泛用于抗AS治疗并显示出良好疗效,比如丹参、赤芍、川芎等,可通过抗炎、调节脂质代谢等方面抑制AS的进展。其中,川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是中药川芎的根茎中提取的有效成分,既往研究显示其可通过具有抑制血小板聚集、平滑肌细胞增殖,抗脂质过氧化和保护血管内皮细胞功能等方面发挥抗AS作用,临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗。铁过载所致的色素沉着及黑斑与中医血瘀证极其类似,那么作为具有代表性的活血化瘀中药-川芎嗪的抗AS效应是否与其抑制铁过载有关?又是否通过影响hepcidin表达而发挥作用?为此我们开展了本项研究。本研究通过构建高脂血症大鼠模型,观察高血脂状态对大鼠血清hepcidin表达的影响,以及抑制hepcidin表达后血管内皮损伤程度的变化情况；为明确hepcidin异常表达与内皮损伤的相关性,借助hepcidin调控子FPN1基因内皮敲除(FPN1Tek-cre)小鼠模型,与同品系小鼠C57BL／6对照观察FPN1 Tek-cre小鼠的内皮损伤程度及功能变化；并在高血脂状态下进一步观察hepcidin上游通路p-Stat3蛋白与p-Smad 1/5/8蛋白表达量的变化；并观察川芎嗪干预后上述模型的内皮损伤、铁代谢及hepcidin相关通路等指标的变化,以期以明确hepcidin参与AS的机制及川芎嗪的干预效应,为AS的发病机理研究及活血化瘀中药抗AS的作用机制研究提供新的思路及科学依据。本课题研究包括以下两部分：文献综述和实验研究。1文献综述：本部分从“动脉粥样硬化与血管内皮损伤机制研究进展”、“铁代谢与斑块稳定性的相关研究进展”和"Hepcidin的生物学效应”三个方面进行综述。2实验研究：包括以下三个部分。研究一高脂血症大鼠hepcidin表达变化对内皮功能的影响目的：探讨高脂血症大鼠hepcidin表达变化对内皮功能的影响。方法：24只SD大鼠随机分为4组：空白对照组(N)、高脂模型组(M)、肝素组(MH)及川芎嗪组(MT),每组6只。除空白对照组以普通饲料喂养外,其余3组均以高脂饲料喂养。8周后,N组及M组给予生理盐水2 ml/(kg-d), MH组和MT组分别给予肝素钠5mg/(kg-d)、盐酸川芎嗪注射液40mg/(kg-d)腹腔注射,连续7天。注射7天后,所有大鼠禁食不禁水8h,腹主动脉取血后分离血清,生化法检测各组血脂,ELISA法检测血清铁调素(Hepcidin) 、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a)、一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的表达。结果：与N组相比,M组、MH组及MT组的血脂水平均显著升高(P<0.05)；M组血清hepcidi、 IL-1、 IL-6、 TNF-a、ET-1、 ROS、MDA含量均有不同程度升高(P<0.05),NO与SOD及CAT降低(P<0.05)。与M组相比,MH组和MT组血清hepcidin、 IL-1、IL-6、 TNF-a、ET-1、 ROS、 MDA含量均有降低(P<0.05,P<0.01),但MH组下降更为明显,而给药两组NO及CAT升高(P<0.05),其中SOD有升高趋势,但组间比较无统计学差异。小结：随着血脂水平升高,hepcidin呈高表达趋势,伴随着大鼠血管内皮损伤程度加重,同时炎症因子表达增加,抗氧化能力下降,内皮功能紊乱。在应用肝素干预后,血脂水平虽没有下降,但是hepcidin表达水平下降,大鼠血管内皮损伤程度减轻,炎症因子表达降低,抗氧化能力有所改善,川芎嗪与肝素有类似作用,故推测川芎嗪对内皮的保护机制可能与其对hepcidin高表达的抑制作用有关。研究二高血脂状态下FPN1基因敲除后小鼠内皮功能的变化目的：通过构建高脂血症模型观察FPN1基因内皮敲除对小鼠内皮功能、氧化应激反应、炎症反应的影响以及川芎嗪的干预效应。方法：80只FPN1 Tek-cre小鼠与40只C57BL/6小鼠均为雌雄各半,分别随机分组,每组20只,共6组,1组C57BL/6小鼠与2组FPN1 Tek-cre小鼠以普通饲料喂养4周,剩余3组以高脂饲料喂养4周,建立高脂血症模型。喂养4周后,将以普通饲料喂养的小鼠中,C57BL/6小鼠设为空白对照组(N),FPN1Tek-cre小鼠随机分为FPN1 Tek-cre小鼠普食组(FN)及FPN1 Tek-cre小鼠普食川芎嗪组(FNT)；以高脂饲料喂养的小鼠中, C57BL/6小鼠设为高脂模型组(M),FPN1 Tek-cre小鼠随机分为FPN1 Tek-cre小鼠高脂组(FM)及FPN1 Tek-cre小鼠高脂川芎嗪组(FMT)。N, M, FN及FM组给予生理盐水2 mL/(kg·d)腹腔注射；FNT及FMT组给予盐酸川芎嗪注射液40mg/(kg·d)腹腔注射,各组注射均连续7天。各组小鼠在注射药物7天后,禁食8 h,每组各抽取5只小鼠,摘眼球取血置于EDTA抗凝的采血管中,用于检测CECs的值。剩余各组小鼠摘眼球取血置于促凝采血管中,分离血清,用于各组小鼠生化法检测血脂、ELISA法检测Hepcidin, NO, ET·1、ROS、 MDA, SOD, IL-1、 IL-6及TNF-a的表达。取血后分离小鼠主动脉与肝脏,将主动脉上端约0.5cm与肝左叶根据标准组织切片技术,固定于4%多聚甲醛中,用于组织切片及HE染色,主动脉剩余部分放于-80℃C冰箱保存,用于组织铁的检测。结果：1.各组小鼠主动脉内铁含量的比较：与N组相比,M组、FM主动脉内铁含量均显著增多(P<0.05),FN组虽有变化的趋势,但差异无统计学意义(P>0.1)；与M组相比,FM组小鼠主动脉内铁含量虽增多的趋势,但差异无统计学意义(P>0.1)；与FM组相比,FMT组小鼠主动脉内铁含量明显减少(P<0.01)。2.各组小鼠血脂水平比较:与N组相比,M组、FM组与FMT组小鼠的血清胆固醇(TC)水平均显著升高(P<0.05)。与M组相比,FM组与FMT组的TC均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.1),而各组的TG(甘油三酯)水平均无明显变化(P>0.05)。3.各组小鼠血清hepcidin的比较：与N组相比,M组、FM组与FMT组的血清hepcidin表达均显著增多(P<0.01),FN组略有升高,FNT组则无显著变化(P>0.1)。与M组相比,FM组的血清hepcidin表达增多(P<0.05),而FMT组的血清hepcidin表达减少(P<0.05)：与FM组相比,FMT组的血清hepcidin表达明显减少(P<0.01)。4.各组小鼠内皮损伤相关指标的比较：与N组相比,M组、FM组与FMT组的血清ET-1水平显著升高(P<0.01),FN组略有升高,FNT组则无显著变化(P>0.1);与M组相比,FM组的血清ET-1水平升高(P<0.05)；与FM组相比,FMT组的血清ET-1水平显著降低(P<0.01)。与N组相比,M组、FM组、FMT组与FN组的血清NO水平均显著降低(P<0.01),FNT组则无显著变化(P>0.1)；与M组相比,FM组的血清NO水平略有降低的趋势(P>0.1)；与FM组相比,FMT组的血清NO水平显著升高(P<0.01)5.各组小鼠氧化应激损伤相关指标的比较：与N组相比,M组、FM组与FMT组的血清ROS、 MDA水平均显著升高(P<0.01),FN组与FNT组的ROS水平存在变化的趋势,MDA水平则无显著变化,差异均无统计学意义(P>0.1)；与M组相比,FM组的血清ROS、 MDA水平有升高的趋势,但差异均无统计学意义(P>0.1)；与FM组相比,FMT组的血清ROS、 MDA水平均显著下降(P<0.01)。与N组相比,M组、FM组、FMT组与FN组的血清SOD水平有不同程度下降(P<0.05,P<0.01),FNT组略有下降的趋势(P>0.1)；与M组相比,FM组的血清SOD水平下降(P<0.05)；与FM组相比,FMT组的血清SOD水平略有升高的趋势(P>0.05)。6.各组小鼠炎症因子水平的比较：与N组相比,M组、FM组与FMT组的血清IL-1、 IL-6及TNF-a水平均显著升高(P<0.01),FN组与FNT组的IL-6水平存在变化的趋势,IL-1与TNF-a水平则无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.1)；与M组相比,FM组的血清IL-1与TNF-a水平均显著升高的趋势(P<0.01),FM组的血清IL-6水平略有升高的趋势(P>0.05)；与FM组相比,FMT组的血清IL-1、 IL-6及TNF-a水平均显著下降(P<0.01)7.各组小鼠肝组织病理变化：与N组相比,FN与FNT组未见明显异常；M组及FM组肝小叶结构欠清,明显可见弥漫性大小不一的圆形脂肪空泡,伴有水样变性、炎性细胞浸润及凋亡的肝细胞,且FM组脂肪样变更重；FMT组较FM组有明显改善8.各组小鼠主动脉组织病理变化：与N组相比,FNT组未见明显异常,FN组出现少量内皮细胞脱落及轻度的结构紊乱,M组及FM组胸主动脉组织均出现了明显的内皮细胞结构紊乱并有脱落,伴中膜增厚,且FM组内皮损伤特征更加明显。川芎嗪干预后FMT组胸主动脉内皮组织结构有明显改善。9.各组小鼠外周血中的CECs变化：与N组相比,M组、FN组、FM组的CECs相对计数均升高(P<0.01),与M组相比,FM组小鼠的CECs相对计数升高(P<0.01)；与FM组相比,FMT组小鼠的CECs相对计数降低(P<0.01)。小结：本研究结果提示,FPN1基因内皮敲除可加重主动脉内的铁过载,引起并加重内皮功能障碍、氧化应激与炎症反应,且在机体高血脂状态下表现更为显著。高脂血症状态可引起血清hepcidin的表达增多与组织内铁过载,而川芎嗪可抑制hepcidin的高表达,减少组织内铁沉积,且对铁过负荷的改善作用更加明显。研究三高脂血症小鼠hepcidin基因和肝脏内p-Stat3与p-S mad 1/5/8表达变化目的：通过检测小鼠肝脏中hepcidin基因的上游调控因子p-Smad1/5/8与p-Stat3的表达,探讨高血脂状态下小鼠肝脏p-Stat3与p-Smad1/5/8表达的变化与川芎嗪干预作用的机制。方法：C57BL／6小鼠24只,普通饲料适应性喂养1w后,随机分为4组,每组6只,其中2组以普通饲料喂养4周,剩余2组以高脂饲料喂养4周,建立高脂血症模型。喂养4周后,将以普通饲料喂养的2组小鼠随机分为空白对照组(N)及普食川芎嗪组(NT),以高脂饲料喂养的小鼠随机分为高脂模型组(M)及高脂+川芎嗪组(MT)。N及M组给予生理盐水2 mL/(kg-d)腹腔注射；NT及MT组给予盐酸川芎嗪注射液40mg/(kg-d)腹腔注射,各组注射均连续7天。各组小鼠在注射药物7天后,禁食8 h,摘眼球取血分离血清后用于hepcidin与生化的检测。分离小鼠肝脏,将肝左叶根据标准组织切片技术,固定于4%多聚甲醛中,用于组织切片及HE染色,剩余部分置于冻存管内迅速放入液氮中,后转移至-80℃冰箱保存,用于p-Smad1/5/8与p-Stat3蛋白表达的检测。结果：1.各组小鼠血脂水平比较：与N组相比,NT组的TC的水平差异无统计学意义(P>0.1),而M组及MT组的血清TC均明显升高(P<0.01)；与N组相比,各组的TG的水平均无明显改变(P>0.1)。2.各组小鼠血清hepcidin的比较：与N组相比,NT组血清hepcidin表达有减少的趋势,但差异无显著统计学意义(0.1>P>0.05),M组血清hepcidin的表达则增多(P<0.01)。与M组相比,MT组的血清hepcidin表达明显减少(P<0.01) 。3.小鼠肝组织病理变化：与N组相比,NT组未见明显异常；M肝组织小叶结构欠清,明显可见弥漫性大小不一的圆形脂肪空泡,伴有水样变性、炎性细胞浸润及凋亡的肝细胞；MT组较M组有明显改善。4.各组小鼠肝组织p-Stat3蛋白的表达情况：与N组相比,NT组p-Stat3蛋白表达明显减少(P<0.05),M组的p-Stat3蛋白表达增多(P<0.05)。与M组相比,MT组p-Stat3蛋白表达明显减少(P<0.05)。5.各组小鼠肝组织p-Smad1/5/8蛋白的表达情况：各组小鼠肝组织p-Smad1/5/8蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与N组相比,M组的p-Smad1/5/8蛋白表达有增多的趋势(P>0.1)。与M组相比,N组、NT组与MT组p-Smad1/5/8蛋白表达均可见减少的趋势(P>0.05)。小结：高血脂状态下p-Stat3蛋白表达量增加,相应hepcidin基因表达也上调,但p-Smadl/5/8无明显变化,川芎嗪可抑制p-Stat3蛋白表达,hepcidin基因表达随之下调,故推测高血脂状态通过激活JAK/STAT途径促进了hepcidin的表达,而川芎嗪下调hepcidin的表达可能是通过抑制JAKs磷酸化STAT3(JAK/STAT途径)来实现的。结论本研究结果提示高血脂可能通过引起血清hepcidin表达增多参与了高脂血症继发血管内皮损伤的发生发展过程,通过观察高血脂状态下小鼠肝脏p-Stat3蛋白表达的变化,推测高血脂状态是通过激活JAK/STAT途径促进了hepcidin的表达。并借助FPN1基因内皮敲除(FPN1 Tek-cre)小鼠研究,发现FPN1基因内皮敲除可加重主动脉内的铁过载,引起并加重内皮功能障碍、氧化应激与炎症反应,且在机体血脂代谢异常的情况下表现更为显著。而川芎嗪的干预可抑制hepcidin的高表达,减少组织内铁沉积,推测这是其保护血管内皮细胞的作用机制之一。