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据称,内源性反转录病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是远古反转录病毒感染时留下的痕迹,构成了机体“virome”的重要组成部分。过去对内源性反转录病毒的功能不够了解,曾将其视为“垃圾DNA”(JunkDNA)。但最近有研究表明,某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用,还可能与病毒感染、天然免疫以及抗肿瘤作用有关。本研究选择内源性反转录病毒一鸡内源性白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup E,ALVE)作为研究模型,应用CRISPR/Cas9系统对鸡1号染色体上存在的内源性反转录病毒ALVE1进行去表达以探索其与天然免疫之间的关系,为进一步研究内源性反转录病毒的功能和作用奠定基础。本研究通过CRISPR/Cas9技术将转录终止序列(SV40ployA)敲入内源性反转录病毒ALVE1的启动子区,通过终止其转录从而实现ALVE1的去功能(Loss of function)。本文不仅成功构建了针对家禽内源性反转录病毒去功能研究的新方法,还为今后研究内源性反转录病毒的功能提供了新思路。主要的研究结果如下:1、ALVE1的鉴定及转录表达分析:首先,应用反式PCR(InversePCR)与cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,成功鉴定了 ALVE1 在鸡 1号染色体的具体位置信息,获得了完整的ALVE1序列。然后,将ALVE1序列分成三部分,分别设计引物进行PCR扩增,结果显示:在鸡巨噬细胞系HD11中含有完整的ALVE1序列,而在鸡成纤维细胞系DF-1中缺乏ALVE1序列。最后,通过PCR鉴定ALVE1在HD11中的转录情况。结果表明:ALVE1的四个区域(即LTR、gag、pol和env)在鸡巨噬细胞系HD11中均能转录表达。2、转录终止元件的筛选:为了筛选高效的转录终止序列,本研究构建了含有转录终止序列以及绿色荧光蛋白GFP的载体,通过对GFP荧光的观察以及荧光定量PCR检测,分别比较SV40polyA、4×SV40polyA、β-globin和P-globinΔ5-7四个转录终止序列的终止效率。结果显示:四个转录终止序列都有较高的终止活性,其终止效率均高于90%。在四个终止序列中,由于SV40polyA的序列最短,本文最终选定SV40polyA作为本研究的终止元件。在此基础上,本文还继续探索了正向与反向SV40polyA的终止效率,结果表明:正向与反向的SV40polyA均有转录终止活性,但是反向序列的终止活性远低于正向序列。3、CRISPR/Cas9介导的ALVE1转录终止及其功能初探:为了实现ALVE1去功能以研究其与天然免疫之间的关系,本文构建了含有转录终止序列的同源重组载体,利用CRISPR/Cas9系统将其敲入ALVE1的启动子区,然后通过嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)双筛选,最终获得了 ALVE1被终止转录的鸡巨噬细胞系(命名为:HDll-ALVEl-Knowdown)。在此研究的基础上,进一步探索了 ALVE1终止表达对细胞天然免疫的影响,通过RT-qPCR检测发现:与正常HD11细胞相比,天然免疫基因TLR3和IFN-β的表达在ALVE1终止表达的细胞中显著下调(P<0.05)。这说明ALVE1与天然免疫密切相关,同时也暗示禽内源性白血病病毒可能与宿主抗病性能有关。