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研究背景主动脉瘤是一种在内外因素作用下主动脉壁结构改变导致主动脉管腔不可逆性扩张,超过正常直径50%的疾病。胸主动脉瘤（Thoracic aortic aneurysm,TAA）则是发生在横膈以上的主动脉瘤。相较于其他常见的心血管疾病,虽然其发病率较低,但由于起病隐匿,早期多无症状。随着疾病的进展,可发生胸主动脉夹层或动脉瘤破裂而危及生命。目前尚无TAA的早期诊断方法和有效的防治药物。因此,阐明TAA的发病机制对其诊断标志物和药物靶点的研究具有重要的理论价值和临床意义。胸主动脉壁由主动脉内膜层,中膜层和外膜层组成。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）作为中膜层的主要细胞成分,在维持管壁结构完整和生理功能方面发挥重要作用,其发生表型转化是TAA发病的关键因素。VSMCs有收缩型和合成型两种表型;稳态下大多数以收缩表型为主,细胞形态呈长梭形,具有较强的收缩能力,增殖迁移能力弱,α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和平滑肌22α（Smooth muscle 22 alpha,SM22α）等收缩相关蛋白表达丰富。而合成表型则在血管发育与疾病过程中发挥重要作用。合成型VSMCs呈现多角形,具有较强的分泌,增殖和迁移能力,骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）,增殖核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）,细胞活性氧类（Reactive oxygen species,ROS）和基质金属蛋白酶类（Matrix metalloproteinase,MMP）分子表达上调。弹力纤维在上调的MMP及ROS等因素的作用下逐渐降解,这使得主动脉的张力和强度难以维持,继而导致扩张。已有研究表明,VSMCs表型转化在TAA的发病中起关键作用。端粒酶是负责端粒延长的一种酶,端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）作为端粒酶的催化核心,是端粒酶的重要组成成分。一直以来,维持有丝分裂后端粒的长度被认为是TERT最重要的功能。越来越多的证据表明TERT在心血管系统中同样发挥重要作用。已有研究证明TERT可以通过调控VSMCs的增殖周期从而参与动脉粥样硬化的发病过程。增殖能力的改变是VSMCs表型改变的重要特征之一。基于此,我们提出科学假设:TERT可能通过调控VSMCs的表型转化参与TAA的发病过程。目的（一）明确TERT在TAA患者及小鼠TAA模型中的表达情况。（二）阐明TERT对VSMCs表型转化的调控作用。（三）探索TERT通过调控VSMCs表型转化参与TAA发病过程的机制。方法（一）人主动脉标本的收集检测与细胞的分离培养鉴定1、人主动脉标本的收集与检测:在排除马凡综合征等遗传性结缔组织疾病,免疫炎症性主动脉疾病和主动脉瓣二叶畸形相关的TAA后,选取经超声及CT血管造影确诊的22例TAA纳入研究,同时选取10例接受心脏移植患者的组织作为正常对照。使用蛋白质印迹法（Western blot）与免疫组织化学的方式检测TERT及VSMCs表型标志物的表达差异。2、细胞的分离和培养:采用组织块贴壁法分离原代大鼠VSMCs并加以培养。处死大鼠,剖开胸腔后体视显微镜直视下分离胸主动脉组织至盛有PBS的无菌培养皿中。而后剥除主动脉内膜和外膜,将剩余中膜层剪成1mm~2大小,贴于24孔板,每孔约2-3块碎组织。随后在每孔内加入约300μl含有20%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的DMEM培养基,贴壁培养等待原代VSMCs爬出。3、VSMCs的鉴定:使用免疫荧光法检测通过上述实验步骤获得的原代细胞中α-SMA的表达情况。（二）小鼠TAA模型的构建与TERT和VSMCs表型标志物的检测1、小鼠TAA模型的建立:通过在C57BL/6小鼠肩胛区皮下埋置血管紧张素II（AngⅡ）缓释泵,持续干预28天的方法构建小鼠TAA模型,同时使用生理盐水缓释泵设置对照组。每7天进行一次胸主动脉组织取材,并行超声检查评估建模效果。2、VSMCs表型与TERT的检测:通过免疫组织化学的方式检测TERT及VSMCs表型标志物在两组中的表达差异。（三）TERT对VSMCs表型转化调控作用的研究1、构建合成型VSMCs模型与VSMCs表型转化模型:使用浓度为10μg/ml的血小板源生长因子（PDGF-BB）刺激大鼠VSMCs以诱导其合成表型模型。依次使用含FBS浓度为1%、5%、10%的DMEM培养基培养VSMCs,构建其表型转化模型。2、过表达TERT:根据TERT相关慢病毒滴度及合适的感染复数（Multiple of infection,MOI）值计算病毒量,加入培养基中感染VSMCs以过表达TERT,随后检测VSMCs表型标志物的表达。3、抑制TERT表达:利用lipofectomne 3000脂质体转染适宜浓度的TERT特异性si-RNA至VSMCs以抑制TERT的表达,随后检测VSMCs表型标志物的表达。4、CCK-8实验:使用CCK-8试剂盒检测VSMCs的增殖活性。5、划痕实验:检测VSMCs的迁移能力。（四）TERT对VSMCs表型转化调控机制的研究1、诱导合成型VSMCs模型,检测自噬水平和TERT的表达。2、抑制VSMCs自噬:使用3-甲基腺嘌呤（3-MA）刺激合成型VSMCs,诱导其自噬抑制模型。检测自噬水平,VSMCs表型和TERT的表达。3、VSMCs中过表达TERT:转染TERT相关慢病毒至VSMCs。检测自噬水平,VSMCs表型和TERT的表达。4、抑制VSMCs自噬后过表达TERT:转染TERT相关慢病毒至3-MA处理后的VSMCs。检测自噬水平,VSMCs表型和TERT的表达。（五）实验数据的统计及分析利用SPSS 20.0软件处理实验数据,两组间比较采用t检验或wilcoxon秩和检验,P＜0.05代表结果的差异具有统计学意义。结果（一）TAA中TERT表达升高,同时伴VSMCs向合成表型转化苏木素-伊红（HE）染色和维多利亚蓝（VB）染色的结果显示,TAA血管壁中膜层结构改变,弹力纤维断裂,胶原纤维杂乱。Western blot和免疫组织化学的结果显示:人TAA组织和小鼠TAA模型中TERT表达升高,OPN和PCNA表达升高,同时伴SM22α表达降低。本部分结果表明,TAA中TERT表达上调,且伴随着VSMCs表型转化过程。提示TERT与VSMCs表型转化过程可能存在相关性。（二）TERT对VSMCs表型转化具有调控作用Western blot结果显示合成型VSMCs中TERT,OPN和PCNA表达升高,SM22α表达降低。VSMCs表型转化模型中,TERT,OPN和PCNA的表达随FBS浓度升高而逐渐上调,SM22α的表达则逐渐下调。转染TERT相关慢病毒至VSMCs的实验结果显示,转染后OPN和PCNA的表达升高,SM22α的表达下降;同时伴VSMCs增殖和迁移能力增强。抑制TERT表达所得的实验结果与过表达TERT相反。本部分的结果表明,TERT对VSMCs表型转化过程具有调控作用,过表达TERT可以诱导VSMCs向合成型转化,抑制TERT的表达则可以逆转该转化过程。（三）TERT通过自噬调控VSMCs表型转化在PDGF-BB诱导的合成型VSMCs模型中检测TERT及自噬相关蛋白的表达,Western blot结果显示合成型VSMCs中TERT和Beclin1表达升高,LC3Ⅱ/Ⅰ的比值升高。抑制VSMCs自噬的结果显示,Beclin1表达降低,LC3Ⅱ/Ⅰ的比值降低,同时OPN和PCNA表达降低,SM22α表达升高,TERT表达无明显变化。在VSMCs中过表达TERT后检测自噬水平,VSMCs表型和TERT的表达,结果显示Beclin1表达上调,LC3Ⅱ/Ⅰ的比值升高,TERT表达上调,同时OPN表达上调,PCNA表达上调,SM22α表达下调。抑制VSMCs自噬后过表达TERT,结果显示过表达TERT可以逆转因自噬缺陷引起的VSMCs的表型转化。本部分的结果表明,TERT可以通过自噬途径调控VSMCs表型转化。结论我们的研究表明:TAA中TERT表达升高,同时伴随着VSMCs向合成型的转化过程;TERT可以通过自噬途径调控VSMCs表型转化从而在TAA的发病过程中发挥重要作用。