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本论文分析了丛毛单胞菌(Comamonas sp.)CNB-1菌株在不同情况下合成聚羟基烷酸(PHA)的组分和含量,并对相关基因和酶进行了研究。结果表明该菌株可以利用多种短链有机酸和醇为底物合成短链PHA。单体中都有3HB的存在,而以戊酸和1,4-丁二醇为底物时可以合成高含量的3HV和4HB,分别可达菌体干重的47.7%及56.2%。二步培养时合成的PHA含量明显高于一步培养时。多种碳源混合时,对于PHA的合成显示出一定的促进或抑制作用,值得注意的是,1,4-丁二醇及其它醇类醇类的存在能促进PHA的合成,推测与醇类氧化过程中产生了更多的还原力有关。
在CNB-1菌株中可以检测到合成短链PHA的硫解酶途径中的3个酶即β-酮硫解酶、乙酰乙酰CoA还原酶和聚合酶的活性,尤其是β-酮硫解酶的活性很高。利用合成酶保守区的简并引物对CNB-1基因组Cosmid文库进行筛选,并对阳性克隆进行测序。从测序得到的约46kb的序列中,找到了编码以上3个酶的基因,以phaCAB的形式组成一个基因簇,phaC前带有一个启动子。将以上3个基因一起连到pET载体在E.coli BL21(DE3)菌株中进行表达后,可以使E.coli合成占菌体千重3%的PHB,同时可以检测到相应的酶活,但酶活较低。进一步将这3个基因单独连接到pET载体进行优化表达后,SDS-PAGE可以检测到明显的蛋白表达条带,酶活明显高于原始菌株,PhaC、PhaA和PhaB的酶活分别约为原始菌株的4.1倍、71倍和2882倍。
由于CNB-1菌株具有很强的以l,4-丁二醇为底物合成4HB聚合物的能力,为了分析其合成途径并找到相关基因,对参与1,4-丁二醇氧化的醇脱氢酶进行了探索性研究。利用分光光度法和非变性凝胶电泳活性染色法的检测,发现存在一个组成型表达的依赖于NAD<+>的1,4-丁二醇脱氢酶。此后对该酶进行了分离纯化,并测定了N端10个氨基酸序列,根据该酶变性前后的大小及其辅因子类型,结合N端氨基酸序列,确定该酶属于依赖于NAD<+>的长链多聚体脱氢酶类群。
除了对CNB-1菌株进行研究外,本论文同时进行了从南海油田沉积物中分离能产生PHA的新种的工作。分离纯化得到约50株菌,采用16S rRNA基因序列分析,表明有三个为新种。经过苏丹黑染色分析,表明其中HY34号能合成PHA。根据多相分类鉴定,将HYl定名为Salegentibacter catena(链状需盐杆菌),将HY9定名为Cyclobacterium lianum (李氏环杆菌属),将HY34定为Rhodobacteraceae中的一个新属,属名为文新菌属(Wenxinia),模式种名为Wenxiniamarina 。